Brug af hæmatopoietisk stamcelletransplantation at vurdere oprindelsen af myelodysplastisk syndrom

Summary

Vi beskriver brugen af hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) til at vurdere det maligne potentiale af gensplejsede hæmatopoietisk celler. HSCT er nyttigt for evaluering af forskellige maligne hæmatopoietisk celler i vivo samt generere en stor kohorte af mus med myelodysplastisk syndrom (MDS) eller leukæmi for at evaluere nye behandlingsformer.

Abstract

Myelodysplastisk syndrom (MDS) er en meget forskelligartet gruppe af hæmatopoietisk stamcelle lidelser, der er defineret af ineffektive bloddannelsen, perifert blod cytopenier, dysplasi og en tilbøjelighed til transformation til akut leukæmi. NUP98-HOXD13 (NHD13) Transgene mus sammenfatte menneskelige MDS perifert blod cytopenier, dysplasi og transformation til akut leukæmi. Vi viste tidligere at MDS vil kunne overføres fra en genetisk manipulerede mus med MDS til wild-type modtagere af omplantning MDS knoglemarv nukleeret celler (BMNC). Til mere klart forstå cellen MDS i oprindelse, vi har udviklet metoder til transplantation specifikke, immunophenotypically defineret hæmatopoietisk undersæt. I denne artikel vil beskrive vi processen med at isolere og omplantning specifikke populationer af hæmatopoietisk stamceller og stamceller. Efter transplantation beskriver vi metoder til at vurdere effektiviteten af transplantation og persistens af donor MDS celler.

Introduction

Myelodysplastisk syndrom (MDS) repræsenterer et mangfoldigt sæt af klonede blodsygdomme karakteriseret af ineffektive bloddannelsen, morfologiske tegn på dysplasi og en tilbøjelighed til transformation til akut myeloid leukæmi (AML)^{1,2 ,3,4}. Ineffektiv bloddannelsen er anerkendt som en modning anholdelse i knoglemarven og resultater i perifert blod cytopenier trods en hypercellular knoglemarv^1,3. Forekomsten af MDS har været skiftevis anslået 2-12 tilfælde pr. 100.000 personer om året i USA, og forekomsten af MDS stiger med alderen, hvilket gør dette en vigtig betingelse for at forstå i betragtning af aldrende amerikanske befolkning^{3, 5}. Selv om de fleste tilfælde af MDS har ingen klar ætiologi, der nogle tilfælde af MDS menes at være på grund af eksponering for kendte genotoksiske stoffer, herunder opløsningsmidler som benzen, og kræft kemoterapi⁶.

MDS patienter har typisk erhvervet mutationer i MDS celler⁷. Selvom relativt ualmindeligt, har en række af MDS patienter erhvervet balancerede kromosomale translokationer involverer gener såsom NUP98, EVI1, RUNX1 og MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Vores laboratorium har en mangeårig interesse i kromosom omplantninger, som indebærer, at NUP98 gen⁸. Transgene mus at udtrykke en NUP98-HOXD13 (NHD13) transgen reguleret af Vav1-promotor og forstærker elementer vise alle nøglefunktioner i MDS, herunder perifert blod cytopenier, morfologiske tegn på dysplasi og transformation til AML⁹ .

Selvom MDS har været anerkendt for over 60 år¹⁰, og anses for at være en klonal stamcelle lidelse, har bestræbelser på at indpode human MDS celle i immundefekte mus været stort set forgæves, fordi MDS celler indpode dårligt^{11, 12,13,14} og musene ikke udvikler kliniske sygdom. I et forsøg på at identificere, hvilke hæmatopoietisk celler kan overføre MDS, vi viste at NHD13 modellen, og viste, at vi kunne indpode MDS som en sygdom enhed, der viste alle de kardinale funktioner af menneskelige MDS, herunder perifert blod cytopenier, dysplasi, og transformation til AML¹⁵. I denne betænkning præsenterer vi de tekniske detaljer i disse eksperimenter samt tilgange til yderligere fractionate hæmatopoietisk stilk og forløber celler (HSPC), i et forsøg på at identificere MDS-indlede celler.

Protocol

De animalske procedurer, der beskrives i denne artikel blev godkendt af National Cancer Institute i Bethesda Animal Care og brug udvalget, og de politikker, der er indeholdt i The Public Health Service politik på human pleje og brugen af forsøgsdyr, er i overensstemmelse med den Animal Welfare Act, og vejledning i pleje og anvendelse af forsøgsdyr. 1. celle forberedelse Høst knoglemarv nukleeret celle (BMNC) Brug kun sterile materialer. Sterilisere genbruges instrumentern…

Representative Results

Vi viser repræsentative tal for resultaterne af flere eksperimenter. Figur 1 viser et repræsentativt flowcytometri sortering eksperiment. Under normale hæmatopoietisk differentiering, som cellerne bliver forpligtet til en specifik hæmatopoietisk afstamning, de erhverve fastlæggelse af afstamning celle overflade markører og mister potentiale til selvfornyelse. Derfor, i wild-type mus, stamcelle selvfornyelse er begrænset til afstamning-negative BMNC. I …

Discussion

Selvom MDS er en klonal hæmatopoietisk stamcelle lidelse, MDS “stammer”, eller igangsættende celler, endnu ikke er blevet karakteriseret. Vi viste tidligere at MDS kan være ender til WT mus med knoglemarv fra NHD13 mus af HSCT, karakteriseret ved makrocytisk anæmi, leukopeni, neutropeni og morfologiske tegn på dysplasi¹⁵. Derudover identificeret konkurrencedygtige genindsættelse assays en vækst fordel af celler fra knoglemarven NHD13 MDS. Taget sammen, indebærer disse konklusioner eksisten…

Materials

14 mL round bottom tube	Falcon	352057
Hank's balanced salt solution	Lonza	10-527F
Anti-CD45.2 antibody	Southern Biotech	1800-15	LOT# A077-T044O
3 mL Syringe	Monoject	8881513934
27-G needle	BD	305109
20-G needle	BD	305176
Lineage Cocktail	Miltenyi	130-090-858	LOT# 5170418221
Anti-Biotin antibodies	Miltenyi	130-113-288	LOT# 5171109046
1 mL Syringe	Excelint	26027	Insulin Syringe
Heating Lamp	Thermo Fisher Scientific	E70001901
FACS machine	Cytec	FACScan	2 lasers, 5 color detectors
FACS sorting instrument	Beckman Coulter	MOFLO ASTRIOS	5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously
Propidium Iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566
Gamma Irradiator	Best Theratronics	Gammacell 40
Blood collection tube	RAM scientific	76011
Recipient mice	Charles River	B6-LY5.1/Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 mice	n/a	C57Bl/6, CD45.2	Colony maintained at NIH
5 mL round bottom tube	Falcon	352058