Une méthode de Culture Proximal pour étudier la signalisation Paracrine entre cellules
Summary
Interactions cellulaires paracrine et juxtacrine jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la progression tumorale, réponse immunitaire, l’angiogenèse et le développement. Ici, une méthode de culture proximale est utilisée pour étudier la signalisation paracrine où les concentrations localisées des facteurs sécrétés sont entretenues tout en empêchant le contact cellulaire direct.
Abstract
Les interactions intercellulaires jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la progression tumorale, réponse immunitaire, l’angiogenèse et le développement. Paracrine ou juxtacrine signalisation intervient dans ces interactions. L’utilisation d’un milieu conditionné et co-culture études sont les méthodes les plus courantes d’établir une distinction entre ces deux types d’interactions. Cependant, l’effet des concentrations élevées localisées des facteurs sécrétés dans le microenvironnement durant les interactions paracrines n’est pas précisément récapitulé par milieu conditionné et, par conséquent, peut conduire à des conclusions imprécises. Pour contourner ce problème, nous avons mis au point une méthode de culture proximal pour étudier la signalisation paracrine. Les deux types de cellules sont cultivées sur une surface d’une membrane de 10 µm d’épaisseur en polycarbonate avec 0,4 µm pores. Les pores permettent l’échange de facteurs sécrétés et, en même temps, inhibent juxtacrine signalisation. Les cellules peuvent être collectées et lysées au point de terminaison pour déterminer les effets de la signalisation paracrine. En plus de permettre des gradients de concentration localisées de facteurs sécrétés, cette méthode se prête aux expériences portant sur des périodes prolongées de la culture, ainsi que l’utilisation d’inhibiteurs. Bien que nous utilisions cette méthode pour étudier les interactions entre les cellules de cancer de l’ovaire et les cellules mésothéliales qu’ils rencontrent sur le site de la métastase, il peut être adapté à n’importe quel deux types de cellules adhérentes aux chercheurs d’étudier paracrine signalisation dans divers domaines, y compris développement, immunologie et microenvironnement tumoral.
Introduction
Le rôle des interactions réciproques productives entre cellules cancéreuses et le microenvironnement tumoral dans la progression tumorale a été clairement établi et est devenu un axe majeur de la recherche en biologie de cancer1. Des cas semblables de bidirectionnel de signalisation sont essentiels pendant la cicatrisation, les réponses immunitaires, angiogenèse, niches de cellules souches et développement2,3,4,5,6 , 7 , 8. un thème commun à tous ces processus biologiques, c’est que les cellules réagissent de différentes façons à des signaux extracellulaires de leur microenvironnement qui déterminent le sort de la cellule, physiologie des tissus et progression de la maladie. Par conséquent, l’accent a plus en plus tourné vers l’élaboration d’une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les communications de ces cellules. Une majorité de ces interactions impliquent paracrine ou juxtacrine de signalisation entre les cellules. Signalisation paracrine implique la sécrétion de facteurs de signalisation spécifiques par une cellule qui sont perçus par des récepteurs correspondants sur une autre cellule dans les environs, déclenchant une réaction dedans9,10, tandis que juxtacrine signalisation nécessite un contact direct entre les composants cellulaires des deux cellules impliqués11,12.
Cette signalisation est une composante essentielle dans l’homéostasie tissulaire, ainsi que dans le microenvironnement tumoral. Les cellules cancéreuses bénéficient de facteurs paracrines et juxtacrine des cellules dans le stroma tumoral, y compris les fibroblastes associés au cancer (CAFs), les cellules immunitaires et les adipocytes13,14,15,16. Le paracrine signalisation peut être médiée par des facteurs de croissance, cytokines, chimiokines, etc., tandis que la signalisation juxtacrine implique des ligands juxtaposés et récepteurs comme signalisation Notch, ou les interactions entre les intégrines et leurs respectifs protéines de la matrice extracellulaire. Nous avons démontré l’importance des interactions réciproques entre les cellules de cancer de l’ovaire et CAFs en tumeur la progression et la métastase14. De même, les interactions entre les cellules métastases de cancer de l’ovaire avec les cellules mésothéliales portant sur le site de la métastase réglementent les microARN clés et facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses qui favorisent la colonisation métastatique17, 18.
La plupart des études sur la signalisation paracrine impliquent l’utilisation d’un milieu conditionné prélevé sur un type de cellule pour traiter le deuxième type de cellule avec. Bien que cette approche a été largement utilisée, il ne réplique pas efficacement les niveaux de haute concentration localisées du facteur sécrété dans le microenvironnement de la cellule réceptrice. Aussi, il ne parvient pas à reproduire la cinétique de l’écoulement continu du facteur sécrété produit par une cellule et reçue par la cellule voisine. Paracrine signalisation est efficace sur de courtes distances, comme les facteurs sécrétés sont aux concentrations requises uniquement dans le voisinage de la cellule source et ont tendance à diffuser et diluer à mesure que la distance augmente. Cette forte concentration localisée du facteur sécrété est indispensable pour déclencher une réponse dans la cellule réceptrice. En outre, la réponse dans les cellules réceptrices dépend aussi l’équilibre des facteurs nouvellement sécrétées et leur épuisement continu par le biais de dégradation, une liaison et internalisation dans les cellules réceptrices et la diffusion de la cellule source. Un milieu conditionné peut être concentré pour tenir compte des plus fortes concentrations localisées présentes dans le micro-environnement, mais qui ne peut pas reproduire avec précision les concentrations exactes. En outre, il ne peut pas imiter la cinétique naturelle de la production et l’épuisement du facteur impliqué. Pour mieux reproduire la signalisation paracrine et séparer de juxtacrine mécanismes de signalisation, nous avons mis au point une méthode de culture de proximal roman, ce qui implique de plus en plus les deux types de cellules sur chaque surface d’une membrane poreuse. Les pores sont suffisamment petits pour empêcher les interactions juxtacrine et encore permettre l’échange de facteurs sécrétés à des concentrations élevées localisées. De cette manière, ce système conserve la cinétique de la production et l’épuisement des facteurs paracrines.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprendre le mécanisme de paracrine et juxtacrine de signalisation entre les cellules est essentielle pour développer une meilleure connaissance du tissu normal homéostasie et maladie conditions7,8. Plupart paracrine signalisation études sont menées en recueillant conditionné milieu à partir d’un type de cellule et l’utiliser pour traiter l’autre type de cellule. Cette méthode a un avantage dans sa simplicité inhérente. Cependant, ce ne pas exact…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes redevables aux patients pour leur participation à la collection de tissus pour ces expériences. Un DoD OCRP Ovarian Cancer Academy Award (W81XWH-15-0253) et un prix pilote de la Fondation de Colleen rêve d’un Anirban K. Mitra prise en charge de cette recherche.
Materials
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
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