שיטה תרבות Proximal ללמוד Paracrine איתות בין תאים
Summary
אינטראקציות סלולרי Paracrine ו- juxtacrine תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל התקדמות הגידול, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה ופיתוח. כאן, שיטה תרבות proximal משמש כדי ללמוד paracrine איתות שבו ריכוז המותאמות לשפות אחרות של הגורמים המופרש נשמרים תוך מניעת מגע ישיר הסלולר.
Abstract
אינטראקציות המערכת תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל התקדמות הגידול, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה ופיתוח. Paracrine או juxtacrine איתות שמתווכת אינטראקציות כאלה. השימוש במדיום ממוזגים ולימודי coculture הן השיטות הנפוצות להפלות בין שני סוגים אלה של אינטראקציות. אולם, השפעת ריכוזים גבוהים המותאמות לשפות אחרות של גורמים המופרש microenvironment במהלך אינטראקציות paracrine לא recapitulated במדויק על-ידי מדיום ממוזגים, לפיכך, עשוי להוביל למסקנות מדויק. כדי להתגבר על בעיה זו, אנו המציאו שיטה תרבות proximal ללמוד paracrine איתות. סוגי תאים בשני גדלים גם פני קרום בעובי מיקרומטר פוליקרבונט 10 עם נקבוביות מיקרומטר 0.4. הנקבוביות לאפשר החליפין של גורמים המופרש ומעכבות, באותו זמן, juxtacrine איתות. התאים ניתן לאסוף ולהשתמש lysed-נקודת הקצה כדי לקבוע את ההשפעות של האיתות paracrine. בנוסף מאפשר למעברי ריכוז המותאמות לשפות אחרות של גורמים המופרש, שיטה זו היא לבצע ניסויים הקשורים תקופות ממושכות של תרבות, כמו גם השימוש של מעכבי. בעוד אנחנו להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד את האינטראקציות בין תאים סרטניים בשחלות התאים mesothelial שהם נתקלים באתר של גרורות, אותה ניתן להתאים לכל סוגי תאים חסיד שני לחוקרים ללמוד paracrine איתות בתחומים שונים, כולל גידול microenvironment, אימונולוגיה ופיתוח.
Introduction
התפקיד של פורה אינטראקציות הדדיים בין תאים סרטניים microenvironment את הגידול בהתקדמות הגידול הוכח גם, הפך מוקד מרכזי מחקר הסרטן ביולוגיה1. מקרים דומים של איתות דו-כיווניים מכריעים במהלך ריפוי, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה, גומחות תאי גזע, הפצע ובמהלך ההתפתחות2,3,4,5,6 , 7 , 8. נושא משותף כל התהליכים הביולוגיים האלה הוא התאים מגיבים בדרכים שונות כדי רמזים חוץ-תאית מ שלהם microenvironment הקובעים גורל, פיזיולוגיה של רקמות, התקדמות המחלה. לכן, המוקד הפך יותר ויותר לכיוון פיתוח הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים בתקשורת תא-תא כזה. רוב האינטראקציות כזה כרוך paracrine או juxtacrine איתות בין תאים. Paracrine איתות כרוך ההפרשה של גורמים איתות ספציפית בתא אחד אשר נתפסים על ידי רצפטורים המתאימים על תא אחר בסביבה, מפעילה תגובה בה9,10, ואילו juxtacrine איתות דורש מגע ישיר בין מרכיבי התא לשני תאים מעורב11,12.
איתות כזה הוא מרכיב קריטי רקמות הומאוסטזיס, כמו גם את microenvironment הגידול. התאים הסרטניים תועלת paracrine גורמים juxtacrine של תאי הגידול stroma, לרבות סרטן הקשורים fibroblasts (CAFs), תאים חיסוניים adipocytes13,14,15,16. Paracrine איתות להיות מתווכת על-ידי גורמי גדילה, ציטוקינים, נוגדנים, וכדומה, ואילו האיתות juxtacrine כרוך ליגנדים juxtaposed קולטנים חריץ איתות, או אינטראקציות בין אינטגרינים שלהם בהתאמה מטריצה חוץ-תאית חלבונים. הראו את החשיבות של אינטראקציות הדדיים בין תאים סרטניים בשחלות CAFs התקדמות, גרורות הגידול14. באופן דומה, לווסת האינטראקציות של תאים סרטניים בשחלות metastasizing עם התאים mesothelial כיסוי האתר של גרורות מיקרו Rna מפתח ואת גורמי שעתוק של תאים סרטניים אשר לקדם קולוניזציה גרורתי17, 18.
רוב המחקרים על paracrine איתות לערב את השימוש שנאספו מכל סוג תא אחד להתייחס את סוג התא השני עם מדיום ממוזגים. בעת גישה זו כבר בשימוש נרחב, זה ביעילות לא לשכפל את רמות ריכוז גבוהה המותאמות לשפות אחרות של הגורם המופרש microenvironment של התא המקבל. זה גם לא יצליח לשחזר את קינטיקה של הזרם רציפה של הגורם המופרש שיופקו בתא אחד, שהתקבלו על-ידי התא הסמוך. Paracrine איתות יעילה במרחקים קצרים כמו הגורמים המופרש נמצאים בריכוזים נדרש רק בקרבת מקור התא, נוטים לפזר ו לדלל את המרחק גודלת. זה הריכוז הגבוה המותאמות לשפות אחרות של הגורם המופרש חיונית כדי לעורר תגובה התא קולטן. יתר על כן, התגובה בתאים הנמען הוא גם תלוי האיזון של דלדול רציפה שלהם דרך השפלה, איגוד, הפנמה תאים הנמען, דיפוזיה מן התא מקור וגורמי לאחרונה המופרש. ממוזגים בינוני יכול להיות מרוכז לחשבון עבור ריכוז מקומי גבוה נוכח microenvironment, אבל זה לא במדויק לשכפל את הריכוזים המדויק. יתר על כן, זה לא יכול לחקות את קינטיקה הטבעית של ייצור, דלדול של הגורם מעורב. באופן מדויק יותר לשכפל paracrine איתות ולהפריד אותו מן juxtacrine איתות מנגנונים, אנחנו המציאו שיטה תרבות proximal חדשניים, אשר כולל גוברת על סוגי תאים שני במשטח או של קרום נקבובי. הנקבוביות הם קטנים מספיק כדי למנוע juxtacrine אינטראקציות, עדיין לאפשר החליפין של גורמים המופרש בריכוזים גבוהים לשפות אחרות. בדרך הזאת, המערכת שומרת את קינטיקה של ייצור, דלדול של הגורמים paracrine.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבנת המנגנון של paracrine ו- juxtacrine איתות בין תאים חיוני לפיתוח ידע טוב יותר של הרקמות הומאוסטזיס ומחלות תנאים7,8. רוב paracrine איתות הלימודים מתנהלים על ידי איסוף ממוזגים בינוני בין תא אחד סוג משתמש בו כדי לטפל בסוג התא השני. בשיטה זו יש יתרון הפשטות הטבועה. עם זאת, זה …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
. אנחנו חבים החולים בשל השתתפותם באוסף רקמות לניסויים אלה. משרד ההגנה OCRP השחלות סרטן האקדמיה פרס (W81XWH-15-0253) פרס פיילוט מקרן קולין החלום כדי מיטרה ק’ חן תמיכה במחקר זה.
Materials
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
Riferimenti
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells – what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Ricerca sul cancro. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Ricerca sul cancro. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination (2016)
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
