कोशिकाओं के बीच Paracrine सिगनल का अध्ययन करने के लिए एक समीपस्थ संस्कृति पद्धति
Summary
Paracrine और juxtacrine सेलुलर बातचीत कई जैविक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, ट्यूमर प्रगति, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, angiogenesis, और विकास सहित. यहां, एक समीपस्थ संस्कृति विधि paracrine संकेतन जहां स्रावित कारकों की स्थानीयकृत सांद्रता प्रत्यक्ष सेलुलर संपर्क को रोकने के बनाए रखा है अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
Abstract
सेलुलर बातचीत कई जैविक प्रक्रियाओं, ट्यूमर प्रगति, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, angiogenesis, और विकास सहित में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । Paracrine या juxtacrine संकेतात्मक मध्यस्थता ऐसी बातचीत । एक वातानुकूलित मध्यम और coculture अध्ययन का उपयोग सबसे आम तरीकों के लिए इन दो प्रकार की बातचीत के बीच भेदभाव कर रहे हैं । हालांकि, paracrine बातचीत के दौरान microenvironment में स्रावित कारकों के स्थानीयकृत उच्च सांद्रता के प्रभाव वातानुकूलित माध्यम से सही ढंग से recapitulated नहीं है और, इस प्रकार, गलत निष्कर्ष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने paracrine सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए एक समीपस्थ संस्कृति पद्धति ईजाद की है । दो सेल प्रकार ०.४ µm pores के साथ एक 10 µm मोटी कार्बोनेट झिल्ली की या तो सतह पर हो रहे हैं । pores स्रावित कारकों के आदान प्रदान की अनुमति है और, एक ही समय में, juxtacrine संकेतन रोकना । कोशिकाओं को एकत्र किया जा सकता है और paracrine संकेतन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए समापन बिंदु पर लीजड ड । स्रावित कारकों के स्थानीयकृत एकाग्रता ढाल के लिए अनुमति देने के अलावा, इस विधि की संस्कृति के लंबे समय से जुड़े प्रयोगों के लिए उत्तरदायी है, साथ ही अवरोधकों के उपयोग. जब तक हम इस विधि का उपयोग डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं और mesothelial कोशिकाओं वे मेटास्टेसिस के स्थल पर मुठभेड़ के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, यह शोधकर्ताओं के लिए किसी भी दो अनुयाई सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता paracrine विभिन्न क्षेत्रों में संकेतन का अध्ययन करने के लिए, जिसमें ट्यूमर microenvironment, इम्यूनोलॉजी, और विकास शामिल है ।
Introduction
कैंसर की कोशिकाओं और ट्यूमर प्रगति में ट्यूमर microenvironment के बीच उत्पादक पारस्परिक बातचीत की भूमिका अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और कैंसर जीवविज्ञान1में अनुसंधान के एक प्रमुख ध्यान केंद्रित हो गया है । द्वि-दिशा संकेतन के समान उदाहरण घाव भरने के दौरान महत्वपूर्ण हैं, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, angiogenesis, स्टेम सेल niches, और विकास के दौरान2,3,4,5,6 , 7 , 8. इन सभी जैविक प्रक्रियाओं में एक आम विषय है कि कोशिकाओं को अपने microenvironment जो कोशिका भाग्य, ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान, और रोग प्रगति का निर्धारण से cues extracellular के लिए विभिंन तरीकों में प्रतिक्रिया । इसलिए, ध्यान तेजी से इस तरह के सेल में शामिल तंत्र की एक बेहतर समझ विकसित करने की ओर बदल गया है सेल संचार । ऐसी बातचीत के बहुमत paracrine या juxtacrine कोशिकाओं के बीच संकेतन शामिल है । Paracrine संकेतन एक कोशिका जो आसपास के क्षेत्र में एक और सेल पर इसी रिसेप्टर्स द्वारा माना जाता है द्वारा विशिष्ट संकेत कारक के स्राव शामिल है, यह9,10में एक प्रतिक्रिया को ट्रिगर, जबकि juxtacrine संकेतन दो कोशिकाओं के सेलुलर घटकों के बीच सीधे संपर्क की आवश्यकता होती है11,12शामिल ।
इस तरह के संकेतन ऊतक homeostasis में एक महत्वपूर्ण घटक है, साथ ही ट्यूमर microenvironment में । कैंसर कोशिकाओं ट्यूमर स्ट्रोमा में कोशिकाओं से paracrine और juxtacrine कारकों से लाभ, कैंसर से जुड़े fibroblasts (CAFs), प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और adipocytes13,14,15,16शामिल हैं । paracrine संकेतन विकास कारकों, साइटोकिंस, chemokines, आदिद्वारा मध्यस्थता किया जा सकता है, जबकि juxtacrine संकेतन पायदान संकेतन में झकझोरता लाइगैंडों और रिसेप्टर्स शामिल है, या integrins और उनके संबंधित के बीच बातचीत extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन । हम डिंबग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं और ट्यूमर प्रगति और मेटास्टेसिस14में CAFs के बीच पारस्परिक बातचीत के महत्व को प्रदर्शित किया है । इसी तरह, मेटास्टेसिस की साइट को कवर mesothelial कोशिकाओं के साथ metastasizing डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिकाओं की बातचीत कैंसर कोशिकाओं जो मेटास्टेटिक औपनिवेशीकरण17 को बढ़ावा देने में प्रमुख microRNAs और प्रतिलेखन कारकों को विनियमित 18.
paracrine संकेतन पर अधिकांश अध्ययनों के साथ दूसरे कक्ष प्रकार का इलाज करने के लिए एक कक्ष प्रकार से एकत्र एक वातानुकूलित माध्यम का उपयोग शामिल है । हालांकि इस दृष्टिकोण व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, यह प्रभावी ढंग से प्राप्त सेल के microenvironment में गुप्त कारक के स्थानीयकृत उच्च एकाग्रता के स्तर को दोहराने नहीं है । यह भी स्रावित कारक के निरंतर प्रवाह के कैनेटीक्स एक सेल द्वारा उत्पादित किया जा रहा है और पड़ोसी कोशिका द्वारा प्राप्त की प्रतिलिपि करने के लिए विफल रहता है । Paracrine संकेतन कम दूरी पर प्रभावी है के रूप में स्रावित कारक स्रोत सेल के आसपास ही में आवश्यक सांद्रता पर हैं और फैलाना और दूरी बढ़ जाती है के रूप में बाहर पतला करते हैं । स्रावित कारक के इस स्थानीयकृत उच्च एकाग्रता रिसेप्टर सेल में एक प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में प्रतिक्रिया भी नए स्रावित कारकों के संतुलन पर निर्भर है और उनके निरंतर घट क्षरण, बंधन के माध्यम से, और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में internalization और प्रसार स्रोत सेल से दूर । वातानुकूलित मध्यम उच्च स्थानीयकृत microenvironment में मौजूद सांद्रता के लिए खाते में केंद्रित किया जा सकता है, लेकिन है कि सही सटीक सांद्रता नहीं नकल कर सकते हैं । इसके अलावा, यह उत्पादन और शामिल कारक की कमी की प्राकृतिक कैनेटीक्स नकल नहीं कर सकते । और अधिक सही paracrine संकेतन दोहराने और यह juxtacrine संकेत तंत्र से अलग है, हम एक उपंयास समीपस्थ संस्कृति विधि है, जो एक छिद्रित झिल्ली की या तो सतह पर दो सेल प्रकार बढ़ शामिल है तैयार किया है । pores काफी छोटे juxtacrine बातचीत को रोकने के लिए और अभी तक स्थानीयकृत उच्च सांद्रता में स्रावित कारकों के आदान प्रदान की अनुमति है । उस रास्ते में, इस प्रणाली के उत्पादन और paracrine कारकों की कमी के कैनेटीक्स बरकरार रखती है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
paracrine और juxtacrine कोशिकाओं के बीच संकेतन के तंत्र को समझना सामान्य ऊतक homeostasis और रोग की स्थिति7,8का एक बेहतर ज्ञान विकसित करने के लिए आवश्यक है. अधिकांश paracrine सिग्नलिंग अध्ययन एक कोशिका प्रका?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इन प्रयोगों के लिए टिशू कलेक्शन में उनकी भागीदारी के लिए हम मरीजों के ऋणी हैं । एक DoD OCRP डिम्बग्रंथि कैंसर अकादमी पुरस्कार (W81XWH-15-0253) और Colleen के ड्रीम फाउंडेशन से एक पायलट पुरस्कार के लिए अनिरबन कश्मीर मित्रा ने इस शोध का समर्थन किया ।
Materials
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
Riferimenti
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells – what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Ricerca sul cancro. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Ricerca sul cancro. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination (2016)
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
