Un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle
Summary
Interazioni cellulari paracrine e juxtacrine gioca un ruolo importante in molti processi biologici, tra cui la progressione del tumore, le risposte immunitarie, angiogenesi e sviluppo. Qui, un metodo di coltura prossimale viene utilizzato per studiare segnalazione paracrina dove le concentrazioni localizzate dei fattori secreti sono mantenute, evitando il diretto contatto cellulare.
Abstract
Le interazioni intercellulari svolgono un ruolo importante in molti processi biologici, tra cui la progressione del tumore, le risposte immunitarie, angiogenesi e sviluppo. Paracrino o juxtacrine segnalazione media tali interazioni. L’uso di un medium condizionato e coculture studi sono i metodi più comuni di discriminare tra questi due tipi di interazioni. Tuttavia, l’effetto di localizzate elevate concentrazioni di fattori secreti nel microambiente durante le interazioni paracrine con precisione non è ricapitolata dal medium condizionato e, così, può portare a conclusioni imprecise. Per ovviare a questo problema, abbiamo messo a punto un metodo di cultura prossimale per studiare segnalazione paracrina. I due tipi cellulari sono coltivati su entrambe le superfici di una membrana di policarbonato spessore µm 10 con 0,4 µm pori. I pori consentono lo scambio di fattori secreti e, allo stesso tempo, inibiscono la segnalazione di juxtacrine. Le cellule possono essere raccolte e lisate sull’endpoint per determinare gli effetti della segnalazione di paracrine. Oltre a consentire per gradienti di concentrazione localizzate di fattori secreti, questo metodo è favorevole agli esperimenti che coinvolgono periodi prolungati di cultura, così come l’uso di inibitori. Mentre usiamo questo metodo per studiare le interazioni tra cellule tumorali ovariche e le cellule mesoteliali che incontrano nel sito di metastasi, può essere adattato a qualsiasi due tipi di cellule aderenti per i ricercatori a studiare paracrine segnalazione in vari campi, compreso lo sviluppo, immunologia e microambiente tumorale.
Introduction
Il ruolo di produttivi interazioni reciproche tra cellule tumorali e del microambiente tumorale nella progressione del tumore è stata ben stabilito ed è diventato degli obiettivi principali della ricerca nel cancro biologia1. Casi simili di segnalazione bidirezionale sono cruciali durante la guarigione delle ferite, le risposte immunitarie, angiogenesi, nicchie di cellule staminali e durante lo sviluppo2,3,4,5,6 , 7 , 8. un tema comune a tutti questi processi biologici è che le cellule rispondono in vari modi a segnali extracellulari da loro microambiente che determinano il destino delle cellule, la fisiologia del tessuto e progressione della malattia. Pertanto, la messa a fuoco, diventato sempre più verso lo sviluppo di una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti in tali comunicazioni cellula-cellula. Una maggioranza di tali interazioni coinvolgono paracrine o juxtacrine segnalazione tra le cellule. Segnalazione di paracrine coinvolge la secrezione di fattori di segnalazione specifici da una cella che sono percepiti da recettori corrispondenti su un’altra cella nelle vicinanze, innescando una risposta in esso9,10, mentre juxtacrine segnalazione richiede un contatto diretto tra componenti cellulari delle due cellule coinvolte11,12.
Tale segnalazione è una componente fondamentale nell’omeostasi del tessuto, così come nel microambiente tumorale. Le cellule tumorali beneficiano di fattori paracrini e juxtacrine dalle cellule nello stroma del tumore, compreso cancro-collegati di fibroblasti (CAFs), cellule immunitarie e adipociti13,14,15,16. Il paracrine segnalazione può essere mediata da citochine, chemochine, fattori di crescita, ecc., mentre la segnalazione di juxtacrine coinvolge giustapposti ligandi e recettori come tacca di segnalazione, o interazioni tra integrine e delle loro rispettive proteine della matrice extracellulare. Abbiamo dimostrato l’importanza delle interazioni reciproche tra cellule tumorali ovariche e CAFs, progressione e la metastasi del tumore14. Allo stesso modo, le interazioni delle cellule di carcinoma ovarico metastatico con le cellule mesoteliali che copre il sito delle metastasi regolano chiavi microRNA e fattori di trascrizione nelle cellule tumorali che promuovono la colonizzazione metastatica17, 18.
Maggior parte degli studi sulla segnalazione di paracrine implicano l’uso di un raccolto da tipo una cella per trattare il secondo tipo di cella con il medium condizionato. Mentre questo approccio è stato ampiamente utilizzato, non vengono replicate in modo efficace i livelli di alta concentrazione localizzati del fattore secernuto nel microambiente della cellula ricevente. Inoltre non riesce a riprodurre la cinetica del flusso continuo del fattore secreto prodotto da una cellula e ricevuto dalla cella vicina. Paracrino segnalazione è efficace su brevi distanze in quanto i fattori secreti sono alle concentrazioni necessarie solo in prossimità della cella di origine e tendono a diffondere e diluire fuori come la distanza aumenta. Questa alta concentrazione localizzata di fattore secernuto è essenziale per innescare una reazione nella cella del ricevitore. Inoltre, la risposta nelle cellule del destinatario è anche dipenda l’equilibrio dei fattori appena secrete e loro svuotamento continuo attraverso la degradazione, l’associazione e interiorizzazione nella cellule recettive e diffusione dalla cella di origine. Il medium condizionato può essere concentrato sul conto per le più alte concentrazioni localizzate presenti nel microambiente, ma che non può replicare con precisione l’esatta concentrazione. Inoltre, esso non può simulare la cinetica naturale della produzione e lo svuotamento del fattore coinvolto. Per maggiore precisione replicare segnalazione paracrina e separarla da juxtacrine meccanismi di segnalazione, abbiamo messo a punto un metodo novello cultura prossimale, che coinvolge coltivare due tipi cellulari su entrambe le superfici di una membrana porosa. I pori sono abbastanza piccoli per evitare interazioni juxtacrine e ancora permettere lo scambio di fattori secreti alle alte concentrazioni localizzate. In questo modo, questo sistema mantiene la cinetica di produzione e lo svuotamento dei fattori paracrini.
Protocol
Representative Results
Discussion
La comprensione del meccanismo di paracrine e juxtacrine segnalazione tra cellule è essenziale per lo sviluppo di una migliore conoscenza del tessuto normale omeostasi e malattia condizioni7,8. Maggior parte paracrine studi vengono condotti attraverso la raccolta di segnalazione condizionata medio da una cella tipo e usarlo per trattare l’altro tipo di cellula. Questo metodo ha un vantaggio nella sua intrinseca semplicità. Tuttavia, esso non accuratamente ricap…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati ai pazienti per la loro partecipazione nella raccolta di tessuto per questi esperimenti. Un DoD OCRP ovarica cancro Academy Award (W81XWH-15-0253) e un pilota premio di Colleen Dream Foundation a Anirban K. Mitra supportato questa ricerca.
Materials
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
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