Proksimale kultur metode å studere Paracrine signalering mellom celler
Summary
Paracrine og juxtacrine mobilnettet interaksjoner spiller en viktig rolle i mange biologiske prosesser, herunder svulst progresjon, immunreaksjoner, angiogenese og utvikling. Her brukes en proksimale kultur metoden å studere paracrine signalering der de lokaliserte konsentrasjonene av secreted faktorene vedlikeholdes mens forebygge direkte mobilnettet kontakt.
Abstract
Intercellulære interaksjoner spiller en viktig rolle i mange biologiske prosesser, herunder svulst progresjon, immunreaksjoner, angiogenese og utvikling. Paracrine eller juxtacrine signalering formidler slik interaksjon. Bruk av en betinget medium og coculture studier er de vanligste metodene for å skille mellom disse to typer interaksjoner. Men effekten av lokaliserte høye konsentrasjoner av utskilles faktorer i microenvironment under paracrine interaksjoner er ikke nøyaktig recapitulated av betinget medium, og dermed kan føre til upresis konklusjoner. Du løser dette problemet, har vi utviklet en proksimale kultur metode for å studere paracrine signalering. De to celletyper dyrkes på enten overflaten av en 10 µm tykke polykarbonat membran med 0,4 µm porene. Porene tillate utveksling av utskilles faktorer og samtidig, hemmer juxtacrine signalering. Cellene kan samles og lysed ved endepunktet å bestemme effekten av paracrine signalene. I tillegg til at for lokaliserte konsentrasjon graderinger utskilles faktorer, er denne metoden mottakelig for forsøk med lengre kultur, samt bruk av hemmere. Mens vi bruker denne metoden til å studere samspillet mellom eggstokkreft celler og mesothelial cellene de møter på stedet av metastasering, kan det tilpasses alle to tilhenger celletyper for forskere å studere paracrine signalering i ulike felt, inkludert svulst microenvironment, immunologi og utvikling.
Introduction
Rollen produktiv gjensidige interaksjoner mellom kreftceller og svulst microenvironment i svulst progresjon er godt etablert og har blitt et hovedfokus for forskning på kreft biologi1. Lignende tilfeller toveis signalnettverk er avgjørende under sårheling, immunreaksjoner, angiogenese, Stamcelle nisjer, og under utvikling,2,,3,,4,,5,,6 , 7 , 8. et felles tema i alle disse biologiske prosesser er at cellene reagerer på ulike måter for ekstracellulære signaler fra deres microenvironment som bestemmer celle skjebne, vev fysiologi og sykdomsprogresjon. Derfor har fokus stadig vendt mot utvikle en bedre forståelse for mekanismene som er involvert i slike celle-celle-kommunikasjon. Et flertall av slike samhandlinger innebære paracrine eller juxtacrine signalering mellom celler. Paracrine signalering omfatter utskillelsen av spesifikke signalnettverk faktorer av én celle som oppfattes av tilsvarende reseptorer på en annen celle i nærheten, utløser et svar i den9,10, mens juxtacrine signalisering krever direkte kontakt mellom cellulære komponenter av to celler involvert11,12.
Så signalering er en viktig komponent i vev homeostase og svulst microenvironment. Kreftceller nytte paracrine og juxtacrine faktorer fra celler i det svulst stroma, inkludert kreft-assosiert fibroblaster (CAFs), immunceller og adipocytter13,14,15,16. Paracrine signalene kan være formidlet av vekstfaktorer, cytokiner, chemokines, etc., mens juxtacrine signalene innebærer juxtaposed ligander og reseptorer som hakk signalering eller interaksjoner mellom integrins og de respektive ekstracellulær matrix proteiner. Vi har vist betydningen av gjensidige interaksjoner mellom eggstokkreft celler og CAFs i svulst progresjon og metastasering14. Tilsvarende regulere samhandling metastasizing eggstokkreft celler med mesothelial cellene dekker området av metastasering nøkkel microRNAs og transkripsjonsfaktorer i kreftcellene som fremmer metastatisk kolonisering17, 18.
De fleste studier paracrine signalering innebærer bruk av en betinget medium samlet inn fra en celle type å behandle andre celle type med. Mens denne tilnærmingen er blitt vidt anvendt, replikerer det effektivt ikke lokaliserte høy-konsentrasjon nivåene av secreted faktor i microenvironment for mottak cellen. Også mislykkes å reprodusere kinetics kontinuerlig flyt av secreted faktor blir produsert av en celle og mottatt av nærliggende cellen. Paracrine signalnettverk er effektiv over korte avstander som secreted faktorene er på de nødvendige konsentrasjonene bare i kildecellen og diffuse og fortynne ut som avstanden øker. Denne lokaliserte høy konsentrasjon av secreted faktor er viktig å utløse en reaksjon i reseptor-cellen. Videre er svaret i mottakerens cellene også avhengig av saldoen nylig utskilles faktorer og utarming deres kontinuerlig gjennom fornedrelse, binding og internalisering i mottakerens celler og diffusion fra kildecellen. Betinget mediet kan være konsentrert kontoen for de høyere lokaliserte konsentrasjonene tilstede i microenvironment, men som ikke nøyaktig gjenskape de eksakte konsentrasjonene. Videre kan det etterligner den naturlige kinetics produksjon og uttømming av faktor involvert. Mer nøyaktig gjenskape paracrine signalering og skiller den fra juxtacrine signalering mekanismer, har vi utviklet en roman proksimale kultur metoden, som innebærer voksende de to celletyper på enten overflaten av en porøs membran. Porene er små nok til å hindre juxtacrine vekselsvirkningene og likevel tillate utveksling av utskilles faktorer på lokaliserte høye konsentrasjoner. På denne måten beholder systemet the kinetics av produksjon og uttømming av paracrine faktorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forstå mekanismen av paracrine og juxtacrine signalene mellom celler er avgjørende for å utvikle en bedre kjennskap til normalt vev homeostase og sykdom betingelser7,8. De fleste paracrine signalering studier er utført ved å samle betinget medium fra en celle type og bruke den til å behandle andre celle type. Denne metoden har en fordel i sin iboende enkelhet. Men det ikke nøyaktig er recapitulate lokaliserte konsentrasjonen av secreted faktorene i cellula…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er gjeld til pasienter for deltakelsen av vev samlingen disse eksperimentene. En DoD OCRP Ovarian Cancer Oscar (W81XWH-15-0253) og en pilot prisen fra Colleen’s Dream Foundation til Anirban K. Mitra støtter denne forskningen.
Materials
| 24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation |
| 6 well plate | Corning (Falcon) | 353046 | Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid |
| 15 cm culture dish | Corning (Falcon) | 353025 | Sterile, TC-treated Cell Culture Dish |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM Vitamins | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Pipets | Any make is fine | ||
| CO2 Incubator | Any make is fine | ||
| Biosafety level II cabinet | Any make is fine | ||
| FN1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan Gene Expression Assay | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA isolation Kit | Qiagen | 217004 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 ovarian cancer cells | Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago | ||
| TGFβ Neutralizing Antibody | R&D Systems | MAB1835-100 |
Riferimenti
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).
- Suvas, S. Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis. The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair. Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).
- Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells – what challenges do they pose. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Elenbaas, B., Weinberg, R. A. Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation. Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).
- Wilson, K. J., et al. EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling. Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).
- Kopan, R. Notch signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
- Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Ricerca sul cancro. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Mitra, A. K., et al. MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer. Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
- Salimian Rizi, B., et al. Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells. Ricerca sul cancro. 75 (2), 456-471 (2015).
- Mitra, A. K., et al. Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis. Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).
- Tomar, S., et al. ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase. Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).
- Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis Available from: https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination (2016)
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).
- Boelens, M. C., et al. Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways. Cell. 159 (3), 499-513 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment. Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).
