Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Summary

Fagosoma, la rimozione fagocitica delle cellule apoptotiche, è necessaria per mantenere l’omeostasi ed è facilitata dalla recettori e vie di segnalazione che consentono il riconoscimento, il engulfment e interiorizzazione delle cellule apoptotiche. Qui, presentiamo un protocollo di microscopia di fluorescenza per la quantificazione del fagosoma e l’attività delle vie di segnalazione efferocytic.

Abstract

Studiare il regolamento del fagosoma richiede metodi che sono in grado di quantificare con precisione l’assorbimento delle cellule apoptotiche e per sondare i processi di segnalazione e cellulari che controllano fagosoma. Questa quantificazione può essere difficile da eseguire, come le cellule apoptotiche sono spesso efferocytosed frammentario, così necessitando metodi che possono delineare con precisione fra la parte di efferocytosed di un target di apoptotic contro residuo unengulfed cellulare frammenti. L’approccio descritto nel presente documento utilizza approcci dual-etichettatura per quantificare con precisione la dinamica della capacità fagosoma ed efferocytic di efferocytes quali i macrofagi. Il citosol della cellula apoptotica è marcati con un colorante di cella-tracking per abilitare il monitoraggio di tutti i materiali di derivati da cellule apoptotiche, mentre superficie biotinilazione della cellula apoptotica consente una differenziazione tra interiorizzata e non interiorizzato frazioni di cellule apoptotiche. La capacità di efferocytic di efferocytes è determinata prendendo immagini fluorescenti delle cellule dal vivo o fisse e quantificare l’importo limite contro bersagli interiorizzati, come differenziato dalla macchiatura streptavidina. Questo approccio offre diversi vantaggi rispetto a metodi quali la citometria a flusso, vale a dire la precisa delineazione di non efferocytosed contro efferocytosed apoptotica frazioni cellulari, la capacità di misurare efferocytic dinamica da microscopia di cellule vive e la capacità di eseguire studi di segnalazione cellulare in cellule che esprimono transgeni fluorescente etichettati. I metodi descritti in questo protocollo combinato, servono come base per un approccio sperimentale flessibile che può essere utilizzato per quantificare con precisione efferocytic attività e interrogare le vie di segnalazione cellulare attive durante fagosoma.

Introduction

L’apoptosi, o morte programmata delle cellule, è un processo fisiologico altamente regolamentato che si verifica nella maggior parte degli organismi multicellulare ed è cruciale per il loro sviluppo e omeostasi¹. Oltre a essere coinvolti nel turnover cellulare normale e lo sviluppo embrionale, apoptosi consente l’eliminazione delle cellule infette o danneggiate dai tessuti e possono essere attivato in risposta all’infezione, infiammazione, tumore e anche di interventi medici ad esempio, la radioterapia o steroidi¹. Le cellule apoptotiche espongono “mangiare-me” segnali sulla superficie cellulare che vengono riconosciuti dai recettori su una gamma di fagociti professionali e non professionali, indicate collettivamente come “efferocytes”. Impegno di questi recettori induce l’assorbimento e la degradazione della cellula apoptotica di efferocyte attraverso un processo noto come fagosoma^2,3. La fosfatidilserina è il meglio caratterizzato mangiare-me segnale guida fagosoma. Normalmente è confinata all’opuscolo interno della membrana plasmatica, con apoptosi attivando un scramblase del lipido che sconvolge questa asimmetria di membrana, esponendo così la fosfatidilserina sulla superficie delle cellule⁴. La fosfatidilserina è trovata sulla superficie extracellulare di alcune cellule non apoptotiche, come macrofagi maturi e piastrine attivate. Tuttavia, queste cellule non sono efferocytosed a causa della presenza di segnali “non mangiarmi”, come CD47, il loro cellulare superficiale^5,6,7. Esposta la fosfatidilserina è riconosciuta da una matrice di efferocytic recettori espressi da efferocytes. Il legame di questi recettori di fosfatidilserina, direttamente o tramite l’ausilio di opsonine, attiva vie di segnalazione che promuovono la fagocitazione della cellula apoptotica in un vacuolo membrana-limita, chiamato il efferosome^{8, 9 , 10 , 11 , 12}. il efferosome in sequenza si fonde con gli endosomi e lisosomi, che trasportano il macchinario molecolare necessario acidificare il efferosome e degradare l’apoptosi delle cellule di carico^13,14. Una volta degradata, i materiali derivati da cellule apoptotiche sono vittime della tratta per il riciclaggio endosoma — un processo che limita la risposta immunitaria agli antigeni derivati da cellule apoptotiche, e che può consentire il recupero di sostanze nutritive dalla apoptotica delle cellule^{13, 15}. Si verifica un errore nel fagosoma in distanza alterata delle cellule apoptotiche; Queste cellule non liquidate alla fine subiscono la necrosi secondaria. Le cellule necrotiche rilasciano contenuto citosolico pro-infiammatorie, agenti patogeni e autoantigeni nell’ambiente extracellulare, guidando così una gamma di malattie infettive, infiammatorie e autoimmuni^16,17. Insieme, apoptosi e fagosoma facilita la rimozione delle cellule morte e morte e consentire il mantenimento dell’omeostasi tissutale.

Indagando i meccanismi molecolari sottostanti fagosoma richiede metodi che forniscono una chiara quantificazione dell’assorbimento delle cellule apoptotiche. Questa quantificazione è complicata dal fatto che a differenza di altri l’assorbimento meccanismi quali endocitosi e fagocitosi^18,19, Fagosoma non possono provocare il engulfment cella obiettivo intatto, conseguente l’assorbimento a fasi della cellula apoptotica di efferocyte²⁰. Il protocollo descritto nel presente documento descrive un in vitro fagosoma saggio che fornisce precisa delineazione dell’interiorizzato contro non interiorizzato porzioni delle cellule apoptotiche individuale e può essere combinato con una varietà di cellula fissa e approcci di microscopia di cellule vive. Saggi di fagocitosi tradizionale aggiungere gli anticorpi specifici per la destinazione fagocitica alla fine dell’esperimento al fine di etichettare gli obiettivi non interiorizzato, dove, come il nostro metodo differisce di etichettatura il bersaglio apoptotiche con biotina covalentemente^{21 , 22}. mentre gli anticorpi specifici di cellule apoptotiche possono essere usati per questo test, l’approccio di biotinilazione consente per qualsiasi destinazione di proteina-cuscinetto di essere etichettato ed evita potenziali problemi con cross-reattività dell’anticorpo secondario se immunostaining viene eseguita . In particolare, delineiamo la preparazione delle cellule Jurkat apoptotiche che sono stati a doppia colorazione con un colorante di rilevamento delle cellule e la biotina. La cella traccianti consente apoptotica materiali derivati da cellule di essere monitorati durante Fagosoma, mentre biotinylation superficie consente la discriminazione di interiorizzato da porzioni non interiorizzato delle cellule apoptotiche efferocytosed. Descriviamo anche la cultura e la preparazione delle linee cellulari J774.2 e THP-1 per uso come efferocytes murine ed umane, macrofagi monocito-derivati M2 come esempio di cellula primaria fagosoma e cellule Jurkat per uso come efferocytic obiettivi. Questi metodi possono essere applicati facilmente ad altre linee cellulari o cellule primarie, a cellule bersaglio che subiscono ogni forma di morte cellulare (ad es. apoptosi, necrosi e necroptosis) che imita micron imprese che simulano le cellule apoptotiche attraverso rivestimenti del lipido o rivestimento con ligandi specifici di un recettore efferocytic di interesse.

Il metodo descritto in questo protocollo ha parecchi vantaggi sopra i metodi di base di citometria a flusso comunemente utilizzati nel campo^23,24. Da imaging direttamente l’interazione delle cellule fagocita-apoptotici, combinato con etichettatura chiaro di entrambi materiale a cellule apoptotiche totale e non interiorizzato, è possono effettuare misure quantitative del fagosoma. Inoltre, l’uso di pH-insensibile fluorofori limita fattori di confondimento quali la soppressione della fluorescenza FITC e GFP a pH lisosomiale che confonde alcuni metodi alternativi²⁵. Infine, mentre non è descritto in dettaglio, questi metodi possono essere impiegati utilizzando efferocytes esprimendo fluorescente etichettati transgeni, o con immunostaining post-fissazione, per consentire la quantificazione delle attività della molecola di segnalazione e monitoraggio della processi cellulari durante fagosoma.

Protocol

Raccolta di sangue dai volontari sani è stato approvato dal comitato di etica in salute scienza ricerca della University of Western Ontario. Il prelievo è stato effettuato conformemente agli orientamenti della Tri-Consiglio informativa sulla ricerca umana. 1. la cultura e la preparazione della linea cellulare di monociti THP-1 Monociti THP-1 di cultura come una coltura di sospensione in matracci T25 a 37 ° C + 5% CO2. Le cellule devono essere coltivate in 5 mL di Roswel…

Representative Results

Una notte di cultura delle cellule Jurkat con risultati di staurosporine 1 µM in apoptosi di > 95% delle cellule, che possono essere confermate con Annessina V macchiatura (Figura 1). Altri tipi di cellule possono essere utilizzati per questi esperimenti, anche se la concentrazione di staurosporine e la durata del trattamento staurosporine dovranno essere ottimizzati per ogni linea cellulare. Per un rilevamento affidabile e la quantificazione del fagosoma, >…

Discussion

I metodi descritti in questo protocollo permettono la formazione immagine e la quantificazione del processo dinamico efferocytic, utilizzando approcci sia fisso-cellula e cellule vive. Questi approcci offrono diversi vantaggi rispetto ai metodi basati su citometria a flusso comunemente impiegate^23,24. L’uso di dentro-fuori la macchiatura con campioni fissati fornisce una più robusta e precisa quantificazione del tasso e l’entità del fagosoma — infatti, molti …

Materials

RPMI 1640 Media	Wisent	3500-000-EL
DMEM Media	Wisent	319-005-CL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	080-150
PBS	Wisent	311-010-CL
18 mm circular glass coverslips #1.5 thickness	Electron Microscopy Sciences	72290-08	Size and shape of coverslip is not critical, but 18 mm fit into the wells of a standard 12-well plate which simplifies cell culture
Staurosporine	Cayman Chemical	81590	Dissolve in DMSO at 1 mM (1,000x stock solution)
Annexin V-Alexa 488	ThermoFisher	R37174
EZ-Link NHS-Biotin	ThermoFisher	20217	Store in a dessicator. Do not prepare a stock solution.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
CellTrace FarRed	ThermoFisher	C34572
CellTrace Orange	ThermoFisher	C34851
Hoescht 33342	ThermoFisher	62249
FITC-Streptavadin	ThermoFisher	SA1001
Lympholyte-poly cell sepration medium	Cedarlane Labs	CL5071
Recombinant Human M-CSF	Peprotech	200-04
Recombinant Human IL-4	Peprotech	300-25
J774.2 Macrophage Cell Line	Sigma-Aldrich	85011428-1VL
THP-1 Human Monocyte Cell Line	ATCC	TIB-202
Jurkat T Cell Line	ATCC	TIB-152