Correlativos luz microscopia electrónica (CLEM) para el seguimiento y proyección de imagen proteína Viral asociada a estructuras en las células inmovilizadas de Cryo

Summary

Un método de microscopía electrónica correlativos (CLEM) se aplica a estructuras intracelulares inducida por virus de imagen mediante microscopia electrónica (EM) en las células que son previamente seleccionadas por microscopía de luz (LM). EM y LM se combinan como un enfoque de imagen híbrida para lograr una visión integrada de las interacciones virus-huésped.

Abstract

Debido a su alta resolución, la microscopia electrónica (EM) es una herramienta indispensable para los virólogos. Sin embargo, una de las principales dificultades al analizar infectado o transfected las células por medio de EM son la baja eficiencia de la infección o transfección, lo que dificulta el examen de estas células. Para superar esta dificultad, microscopía de luz (LM) se puede realizar primero para asignar la subpoblación de células infectadas o transfected. Así, aprovechando el uso de proteínas fluorescentes (FPs) unida a las proteínas virales, LM se utiliza aquí para registrar las posiciones de las células “positivo-transfected”, expresando una FP y creciendo sobre un soporte con un patrón alfanumérico. Posteriormente, las células son procesadas más de EM con alta presión (HPF) de congelación, congelación de resina incrustación y sustitución (FS). El paso de congelación ultra rápido garantiza la preservación excelente de la membrana de las celdas seleccionadas que luego pueden ser analizadas a nivel ultraestructural por microscopia electrónica de transmisión (TEM). Aquí, se proporciona un flujo de trabajo de microscopía de electrones luz correlativa paso a paso (CLEM), describiendo la preparación de la muestra, la proyección de imagen y correlación en el detalle. El diseño experimental se puede aplicar también para hacer frente a muchas preguntas de Biología de la célula.

Introduction

La idea de combinar dos modalidades de microscopía para obtener una mejor imagen de un proceso biológico específico es bastante vieja. Así, el primer estudio acerca de los virus con “microscopía correlativa” se publicó en 1960 como dos publicaciones separadas^1,2. En ese estudio, los autores analizaron los cambios en la morfología del núcleo inducida por adenovirus por medio de dos técnicas de microscopía. En la primera publicación, observaciones de microscopía electrónica (EM) que describe los detalles morfológicos asociados con la infección del adenovirus fueron reportados¹. En una segunda publicación, las diferentes estructuras observadas por EM se correlacionaron con las imágenes de microscopía de luz (LM) de patrones de tinción histoquímicos, para definir la naturaleza de las estructuras previamente observado por EM².

En estos estudios iniciales, sin embargo, sus observaciones se realizaron utilizando diferentes células infectadas como experimentos independientes. La “correlación”, de hecho, iba como la combinación de información proveniente de dos modalidades de imágenes para comprender un fenómeno, comparando todos los hallazgos que han sido obtenidos con diferentes ensayos para entender una determinada biológica proceso.

En la actualidad, la microscopía correlativa del término, también conocido como correlativa luz y la microscopia (CLEM), se aplica a un número creciente de métodos (revisado en referencias^3,4,5), con la concordancia que ambas técnicas de imagen (EM y LM) se llevan a cabo en la misma muestra. Resultados de la combinación de ambos métodos, de tal modo, en un análisis multimodal, multiescalar y multidimensional de la muestra³. Las ventajas son que LM puede proporcionar una amplia visión de muchas células diferentes, lo que permite la identificación de subpoblaciones de células expresan una proteína o proteínas de interés dentro de una población celular heterogénea. EM supera el límite de resolución de LM, proporcionando una mayor resolución de imagen de un evento en particular intracelular. Además, la EM permite la visualización del contexto subcelular no fluorescente, incluyendo todos los organelos de membrana enlazado, grandes complejos macromoleculares (por ejemplo, los ribosomas, centriolos, etc) y elementos citoesqueléticos, así proporcionando información espacial adicional, el llamado “espacio de referencia”⁶y dar contexto a la mancha fluorescente detectada por LM.

Durante los últimos años, CLEM se ha convertido en una herramienta poderosa no sólo para biólogos de la célula⁵, sino también para los virólogos (revisados en la referencia⁷) dispuestos a comprender la interacción virus-célula compleja que conducen a una propagación de virus exitoso. Por lo tanto, entender cómo los virus modifican las membranas celulares y orgánulos para su propio beneficio es esencial para el desarrollo de fármacos antivirales para erradicar virus patógenos.

Aquí, CLEM describe un método es que permite la detección de LM de las células que expresan proteínas virales que unida a una proteína fluorescente (FP). Estas células son posteriormente cryo-inmovilizado y más preparados para análisis ultraestructural por microscopia electrónica de transmisión (TEM) para obtener nuevos conocimientos sobre cómo la expresión de estas proteínas reorganizar las membranas intracelulares (figura 1). CLEM ha llevado a cabo con células químicamente fijas en la mayoría de los estudios de virología publicados a fecha^{8,9,10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19}. Esto es principalmente debido a la necesidad de inactivar el material infeccioso por razones de bioseguridad en nivel 2 de bioseguridad y laboratorios (BSL-2 y BSL-3)-3, donde crio-inmovilización de células no es generalmente posible. Para aquellas preguntas que requieren una conservación óptima de las membranas celulares, vitrificación mediante alta presión (HPF) de congelación, sin embargo, recomienda²⁰. En estos casos, se puede aplicar el protocolo de CLEM descrito aquí. Interesante, especialmente cuando se trabaja con muestras infecciosas, HPF puede realizarse en muestras que han sido previamente inactivadas químicamente, por ejemplo en laboratorios BSL-2 y BSL-3. La combinación de fijación química seguida de HPF es una posibilidad de por lo menos parcialmente se benefician de las ventajas de la criopreservación métodos^21,22.

Figura 1 : Representación esquemática del flujo de trabajo para el análisis de las células a través de CLEM. Las células crecen en discos zafiro estampados primero son analizadas por LM para localizar las células expresaban FPs antes de su tratamiento para la EM. Una vez localizado, las células se fijan inmediatamente por HPF y FS para posteriormente ser embebido en resina. En la polimerización de la resina, el soporte donde fueron creciendo las células (= discos zafiro) debe extraerse el bloque de resina. El bloque que contiene las células incrustadas se recorta a un pequeño trapecio que las células restantes, expresando FPs, se seccionaron con un cuchillo de diamante. Secciones ultrafinas son recogidas en rejillas de ranura y más examinadas por TEM para obtención de datos ultraestructurales de estas células. Esta cifra es adaptada y modificada con permiso de referencia²⁹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. preparación de zafiro con discos para cultivo celular Transferencia de los discos de zafiro estampados (véase Tabla de materiales), con un patrón alfanumérico grabado al agua fuerte en una de sus superficies, en un tubo de centrifugación cónicos de 15 mL.Nota: Como alternativa, discos zafiro espesor de 0,05 mm convencional sin patrón alfanumérico pueden utilizarse en que un patrón de referencia se crea con este recubrimiento con una cuadrícula de buscador en la parte superior. Para ello, se debe limpiar con etanol antes de aplica el patrón de carbono. Lavar bien con etanol. Difunde hacia fuera en una placa de Petri con papel filtro y deje secar. Coloca en un portaobjetos de vidrio separadas entre sí con unas pinzas largo delgadas. Consulte con un microscopio invertido (4 aumentos) el patrón de coordenadas sea legible sobre cada disco de zafiro.Nota: Este no es el caso, la vuelta a los discos de zafiro con la ayuda de las pinzas. Guarde los discos de zafiro en una placa Petri.Nota: El protocolo se puede detener aquí. 2. célula cultura con discos zafiro estampadas Esterilizar los discos zafiro estampados con un crosslinker (UV) ULTRAVIOLETA durante 5 minutos. Tomar los discos de zafiro para la bioseguridad de cultura celular gabinete. Esterilice las pinzas largas con etanol en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Añadir la mitad de medio de cultivo celular (véase Tabla de materiales) a una placa de cultivo celular. Transferir los discos zafiro cuidadosamente con las pinzas largas en la placa de cultivo celular. Semilla 1 x 105 Huh7 Lunet las células, estable que la polimerasa T7 suspendida en la otra mitad del medio de cultivo celular, sobre el plato de cultura.Nota: Calcular el número de células a ser sembradas de tal manera que en el punto final del experimento la confluencia celular debe ser de no más de 20 – 30%. Alta densidad celular dificultará el traslado de las células en etapas posteriores de EM. Además, sobre confluencia podría resultar en el desprendimiento de las células de los discos de zafiro. Compruebe que los discos de zafiro siendo en la parte inferior de la placa de cultivo y que las coordenadas alfanuméricas son todavía legibles con el microscopio invertido.Nota: Si los discos de flotan en el medio de cultivo celular, utilice pinzas largas para empujar los discos en la parte inferior y, eventualmente, dar la vuelta a la orientación correcta. Transfectar las células al día siguiente según lo divulgado previamente en referencias21,23 siguiendo las instrucciones del fabricante del agente de la transfección. 3. LM la proyección de imagen de células creciendo en discos zafiro estampados Transferencia de los discos de zafiro en el punto final del experimento a una placa de metal que contienen 30-50 μl de medio libre de indicador de pH para reducir la fluorescencia del fondo no específico de posición.Nota: La placa de metal descrita aquí (figura 2) ha sido diseñada en el taller de laboratorio de Biología Molecular europeo (EMBL). En la ausencia de esta placa o uno similar, platos de fondo de cristal de la célula cultura podrían también usarse para LM. Es importante cambiar el medio de cultivo normal de la célula por medio sin indicador de pH. Tenga en cuenta también que tiempos de exposición largos deben evitarse porque pueden causar fotoblanqueo, conduciendo a la acumulación de oxígeno reactivo (ROS) de especies y daño fisiológico de las células24,25. Imagen de las células bajo un microscopio de fluorescencia invertido widefield.Nota: Cuando se utiliza una proteína fluorescente verde (GFP)-proteína de etiquetado, como se muestra en los resultados representativos, 450-490 nm y 500-550 nm de excitación y emisión de los filtros, respectivamente, pueden usarse. Adquirir primero una imagen de bajo aumento (10-20 X) de las células a asignar las células expresaban FPs. registro las coordenadas de los discos de zafiro con dibujos donde se encuentran las células de interés mediante el uso de microscopía de contraste (DIC) de interferencia diferencial.Nota: Costura varias áreas podría contribuir a una mejor visión de la ubicación de las celda/células de interés. Observe que también eso microscopia de contraste de fase podría ser opcionalmente utilizado aquí. Adquisición de imágenes de gran aumento (fluorescencia y DIC) (63 – 100 X, objetivos de inmersión en aceite) de las misma celda/celdas para mejor discernir la localización subcelular de la proteína de interés dentro del espacio intracelular.Nota: Imágenes DIC proporcionan información contextual. Esta información es a menudo esencial para correlacionar imágenes de LM con micrografías de EM, ya que la correlación final es más precisa con puntos “anatómicos” de la célula. Como algunos discos zafiro podrían romperse durante la inmovilización de crio, se recomienda preparar triplicados por condición. Además, algunas células separan discos durante HPF y los pasos posteriores de este protocolo, mientras que la ultraestructura de otras células puede contener artefactos como consecuencia de la congelación daño. Por lo tanto, al menos dos áreas de los discos deben ser reflejadas a través de LM para que al final habrá suficientes células para su análisis. Lo importante, estas dos áreas deben en lados opuestos del disco. De esta manera el bloque de resina donde se encajan las células puede ser cortado en dos mitades y las secciones de estas áreas pueden obtenerse. Figura 2 : Esquema de la proyección de imagen de LM de células crecen en patrón discos zafiro. (A) los discos de zafiro se transfieren con ayuda de Pinzas finas a una placa de imagen. (B-C) Esta placa ha sido especialmente diseñada en el taller EMBL en Heidelberg para encajar en el microscopio de luz, donde los discos de zafiro pueden ser reflejados con medio de cultivo celular sin indicador de pH. Consiste en una diapositiva del metal, 75 mm x 25 mm x 1 mm, con cuatro o cinco agujeros molidos en él con una broca de 3 mm para ajustarse al tamaño de los discos de zafiro. Además, fueron molidos surcos pequeños en cada lado de los orificios en un ángulo de 90°. Estos orificios hacen más fácil acceder a los discos con pinzas cuando manipulándolos. Para permitir las condiciones óptimas de imagen cubreobjetos de vidrio no. 0 (0.085 a 0.13 mm de espesor) fueron pegados por debajo de los agujeros con pegamento Ultravioleta y coloca bajo luz ultravioleta para endurecer. Imagen de alta magnificación (D) del disco de zafiro con dibujos que representan las coordenadas alfanuméricas que están grabadas en su superficie. Los discos de zafiro estampados están disponible comercialmente (véase Tabla de materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 4. Cryo-inmovilización de células creciendo sobre zafiro estampada discos via HPF Colocar los portadores de aluminio “A” y “B” para HPF (véase Tabla de materiales) en una placa de Petri con papel filtro humedecido con 1 hexadecene. Sumergir los discos de zafiro estampados que contiene las células en una placa Petri con 1 hexadecene.Nota: Mover los discos un poco para eliminar el medio de cultivo celular. Montar los discos de zafiro entre una “A” y un portador de aluminio “B” en el soporte de HPF como sigue (figura 3B). En la parte inferior, coloque un portador “B” con la parte plana hacia arriba. Coloque los discos de zafiro en este lado plano con las celdas mirando hacia arriba. Añadir un “A” portador con su profundidad de 0,1 mm frente a las células.Nota: Porque los discos de zafiro estampados son más gruesos que los convencionales discos zafiro, el portador disponible en el mercado “A” (diseñado para ser usado con discos zafiro de 0.05 mm no modelado) tuvo que ser cortado hasta 0,05 mm en este lado de 0,2 mm de profundidad en el EMBL Taller para montar en el soporte de HPF (figura 3A). Para ello, el portador de la “A” se inserta en el extremo de un tubo de metal para que su lado de 0,2 mm se expone y sigue siendo todavía durante el corte hacia abajo. El corte hacia abajo de lado luego se lija para que los plano. Como alternativa, puede utilizarse un soporte especial de aluminio encima del disco de zafiro estampado (disponible en el mercado, véase Tabla de materiales), siendo en este caso el HPF “sandwich” compuesto por sólo el disco de zafiro y este portador. Cierre el soporte de la máquina de HPF y la congelación de las células.Nota: Este protocolo es específico para una determinada máquina de HPF. Otras máquinas de HPF podrían ser también usado6,26. En cualquier caso, tenga en cuenta la existencia de máquinas de nueva generación de los proveedores.PRECAUCIÓN: Use gafas y auriculares de protección auditiva. Coloque el “sándwich” congelado en una caja de poliestireno con nitrógeno líquido para el almacenamiento temporal.PRECAUCIÓN: Use gafas y ponerse en contacto con los oficiales de seguridad locales para estar informado sobre los peligros potenciales, al manipular nitrógeno líquido. Para evitar confusiones, colocar cada “emparedado” en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mL separadas (dentro de la caja de poliestireno) marcada con un número.Nota: El protocolo se puede detener aquí. Si no puede realizarse inmediatamente congelación sustitución (FS), las muestras pueden almacenarse en cryo-tubos (con un agujero perforado en la parte superior) dentro de cajas, que se celebran en un rack en un nitrógeno líquido criogénico dewar (véase Tabla de materiales). Este contenedor de nitrógeno líquido debe estar ubicado en una sala con sensores de gas de oxígeno, para evitar la asfixia en caso de una deficiencia de oxígeno.PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos que se describen a continuación (pasos 5 y 6) deben llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad. Además, la mayoría de los reactivos usados es peligrosa. Antes de usarlos, es obligatorio leer las hojas de datos de seguridad Material suministrado por los fabricantes, así como pedir a los oficiales de seguridad sobre las normas locales para garantizar una manipulación segura. Para la correcta disposición de estos materiales, así como para el uso adecuado de los equipos descritos a continuación, también se requiere consultar los procedimientos de seguridad y salud del Instituto local. Figura 3 : Esquema de la Asamblea de zafiro estampada discos entre dos portadores de aluminio para HPF. (A) vistas cortadas de un operador convencional “A”, que tiene que ser cortado en su parte más profunda de 0,2 mm a 0,05 mm. (B) el disco de zafiro grueso 0.16 m m con el patrón alfanumérico grabado al agua fuerte en la superficie está montado en dos portadores de aluminio para HPF , como sigue: el disco de zafiro es colocado sobre la parte plana de un operador “B” con las celdas mirando hacia arriba. Una picada “A” portador con su profundidad de 0,1 mm frente a las células se coloca en la parte superior para cerrar el “sandwich de HPF”. Los portadores de aluminio y los discos de zafiro estampados están disponible comercialmente (véase Tabla de materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 5. FS de células Cryo-fijos Llene la máquina FS (véase Tabla de materiales) con nitrógeno líquido. Ajuste la temperatura a-90 ° C y esperar hasta que la máquina llegue a esta temperatura. Preparar el medio de FS con tetróxido de osmio 0.2% (OsO4) (v/v), 0,1% acetato de uranilo (UA) (w/v) en agua destilada el vaso acetona mientras la máquina FS es enfriamiento.Nota: Para preparar, (por ejemplo) 12 mL de medio de FS, mezcle 600 μl de 4% OsO4con 0,012 g de au en un recipiente pequeño de vidrio. Disolver esta mezcla en un dispositivo de ultrasonido baño por 5 minutos Añadir 11,4 mL de acetona destilada de cristal con una pipeta y mezclar bien. Llenar tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con 200-500 μl de medio de FS, cierre la tapa y transferirlos a la máquina de FS. Esperar 10 minutos para el medio de FS se enfríe. La transferencia de los congelados “bocadillos” que contiene los discos de zafiro con las células en nitrógeno líquido con unas pinzas largo enfriadas a los tubos conteniendo el medio de FS.PRECAUCIÓN: Uso crio-guantes y gafas.Nota: El HPF “sándwiches” podría desmontarse espontáneamente durante su manejo. En este caso, asegúrese de que los discos de zafiros congelados son trasladados a los tubos de microcentrífuga. Los portadores de aluminio pueden ser desechados. Ejecutar el FS como sigue hasta el próximo día27: de-90 ° C a-80 ° C durante 8 h; de-80 ° C a-50 ° C durante 8 h; de-50 ° C a-20 ° C por 2 h; de-20 ° C a 0 ° C por 2 h. 6. resina, incrustación de congelación sustituir muestras PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos que se describen a continuación deben llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad. Además, la mayoría de los reactivos usados es peligrosa. Antes de usarlos, es obligatorio leer las hojas de datos de seguridad Material suministrado por los fabricantes, así como pedir a los oficiales de seguridad sobre las normas locales para garantizar una manipulación segura. Para la correcta disposición de estos materiales, así como para el uso adecuado de los equipos descritos a continuación, también se requiere consultar los procedimientos de seguridad y salud del Instituto local. Sacar las muestras substituidas de la máquina de FS y coloque en hielo por 20 min. Mantener las muestras a temperatura ambiente durante 20 minutos y lavarlos bien (3 veces 10 min cada uno) con agua destilada el vidrio de la acetona. Deseche los portadores de aluminio con pinzas largas si todavía se encuentran en los tubos de microcentrífuga después el FS. Infiltrarse en las células (en los restantes discos zafiro) en una serie de resina epoxy de cuatro pasos con incubaciones de 1 h en 25%, 50% y 75% resina en acetona destilada de cristal, seguido por la incubación durante la noche con 100% resina. Intercambio de la resina 100% al día siguiente durante 1 hora. Coloque con cuidado los discos zafiro en flujo anillos montados en baños de reactivo con 100% resina. Estos anillos se utilizan como moldes de polimerización de 10 discos zafiro.Nota: Los discos de zafiro deben totalmente empujar hasta el fondo con las coordenadas hacia arriba de manera legible. Esto podría comprobarse con ayuda de un binocular conectado a un extractor de humos. Alternativamente, un binocular dentro de un gabinete de bioseguridad podría utilizarse en su lugar. Lo importante, son los números (1-10) grabados en la parte inferior de los reactivos que ayudan a identificar las muestras.  Además, para la identificación de las muestras podría incluirse una etiqueta de papel en el bloque de resina. Polimerizar las muestras en el horno a 60 ° C durante 48 h. 7. retiro de discos zafiro con dibujos de los bloques de resina polimerizada Retire los bloques de resina que contienen las células del horno.Nota: El protocolo se puede detener aquí. Si no, deje que los bloques se enfríe a temperatura ambiente antes de cortarlos. Cortar los moldes de inclusión con una cuchilla de afeitar para tener acceso a los bloques de resina. Retire los bloques de resina cilíndrico con unas pinzas.Nota: Si una etiqueta de papel no ha sido incluida en la resina bloque antes de la polimerización, el número de los bloques con un marcador permanente y almacenar en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. El protocolo puede hacer una pausa aquí. Sumerja la punta del bloque de resina que contiene el disco de zafiro en una caja de poliestireno que contienen nitrógeno líquido hasta que deje de “burbujear”. Luego, sumerja la punta del bloque de resina en ebullición del H2O. Repita los dos pasos anteriores tantas veces como sea necesario hasta que el disco de zafiro cae fuera del bloque de resina.PRECAUCIÓN: Use gafas y guantes de crioprotectores.Nota: Si esto no funciona, utilice una cuchilla para quitar un poco de la resina polimerizada alrededor de los discos antes de intentar otra vez. El protocolo puede hacer una pausa aquí. 8. objetivo de corte y seccionamiento ultrafino para TEM Identificar el área en la cara del bloque de resina donde las células de interés mediante el examen de la cara del bloque con el binocular de un ultramicrótomo.Nota: Se conserva la impronta negativa del patrón coordinado desde los discos de zafiro estampados en la cara del bloque. Esto permite la identificación de la zona donde se encuentra para el ajuste objetivo las células de interés. Las imágenes de la LM deben dar la vuelta verticalmente para facilitar el hallazgo de la misma posición de la cara del bloque. Recortar la monocapa celular incrustado que contiene las células/células de interés para una pequeña pirámide plana con la forma de un trapecio (~ 200 μm × 250 μm tamaño promedio) con una cuchilla de limpieza. Obtener secciones ultradelgadas 70 nm de las células de encajado con un cuchillo de diamante de 35°. Coloque las secciones de rejillas de ranura de EM con ayuda de pinzas ultra finas.Nota:: el uso de malla rejillas deben evitarse porque podrían enmascarar las secciones por las barras de rejilla. Almacenar las rejillas en una caja de rejilla.Nota: El protocolo se puede detener aquí. 9. TEM análisis de secciones ultrafinas Coloque la parrilla de la ranura en el soporte del microscopio electrónico de transmisión. Adquisición de imágenes de baja magnificación (Resumen), donde es visible el perfil completo de la célula de la célula de interés.Nota:: células y célula de interés pueden encontrarse nuevamente mediante los perfiles de la célula y la localización de las células entre sí como referencias, en comparación con las vistas DIC adquiridas antes por LM. Adquisición de imágenes de gran aumento de células y célula de interés, para tratar de encontrar, a nivel ultraestructural, características que corresponden a las señales fluorescentes observadas previamente por LM.Nota: Pueden obtenerse imágenes de montaje en alta ampliación para tener una visión en alta resolución de células y célula de interés. Además, a menudo es necesario para la adquisición de imágenes de la misma célula en las secciones seriales consecutivas para poder reconstruir la célula en 3D antes de comparar a las imágenes de fluorescencia.

Representative Results

Utilizando el procedimiento presentado aquí (figura 1), las células Huh7 Lunet estable expresando la T7 ARN polimerasa fueron sembradas en discos de zafiros con dibujos y posteriormente transfectadas con un plásmido de expresión de dos dominios del virus de la Hepatitis C (HCV) proteína no estructural NS5A, etiquetadas con GFP (pTM_AH-D1-GFP) (figura 4). Al día siguiente, los discos zafiro estampados, donde las células crecen, se sacan los platos de cultivo celular y reflejados por medio de la LM (figura 4, figura 2). Esas células que expresan la GFP-D1-AH fueron identificados por la presencia de fluorescencia verde en el citosol y grabados para salvar sus posiciones dentro del coordenadas-patrón de los discos de zafiro (figuras 5A, 5B). Inmediatamente después de su examen de LM, los discos de zafiro que contiene las células de interés fueron montados entre dos portadores de aluminio (figura 3) y sometidas a cryo-inmovilización por HPF. Las células fueron entonces congelar substituido y posteriormente embebida en una resina epóxica. Al retirar los discos de zafiro de los bloques de resina polimerizada, la impronta del patrón alfanumérico era visible en la cara del bloque, que permitió recuperar las áreas donde se encontraban las células de interés. El resto del bloque de resina fue recortado distancia para generar un pequeño trapecio que las células de interés. Las secciones ultrafinas seriales fueron obtenidas de este trapecio, recogidas en rejillas de ranura de EM y más analizadas por TEM (figura 5C). Tenga en cuenta que obtener manualmente serial secciones consecutivas aunque es factible28 intensivo de mano de obra y requiere de personal bien entrenado. También es importante que las células tienen una confluencia baja cuando se someten a este protocolo de CLEM (figura 5A) con el fin de garantizar una rápida identificación de la misma célula previamente identificada por LM. De lo contrario, tener mayor confluencia celular podría dramáticamente disminuir la localización exitosa de las células a nivel de EM. Análisis de temperatura de varias secciones ultrafinas de la célula de interés (figuras 5, 5E), expresando la AH-D1-GFP, reveló la presencia en su espacio intracelular de grandes acumulaciones de vesículas de morfología variable, delimitada de la alrededor de citosol por una bicapa de lípidos individuales (figura 5E). Figura 4 : Representación esquemática del flujo de trabajo seguido para llevar a cabo el ejemplo de CLEM en Figura 5 . Las células Huh7 Lunet estable expresando la T7 ARN polimerasa fueron transfectadas con un plásmido de ADN codifican el anfipáticos helix (AH) y el dominio 1 (D1) de la proteína NS5A del VHC, la etiqueta en su c-terminal con GFP (GFP-D1-pTM_AH). Se controla la expresión de esta parte de la proteína NS5A transcripcionalmente por un promotor T7 (T7 Pm) y forma por un elemento Encefalomiocarditis (EMCV) de virus IRES (sitio de la entrada interna del ribosoma), indicado por una estructura secundaria. Patrón de células de la transfección (hpt 24) 24 h en discos zafiro y expresan la GFP-D1-AH fueron detectados por LM y sometido inmediatamente a HPF-FS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5 : Ejemplo de un procedimiento de CLEM. (A) Huh7 Lunet células expresando estable la polimerasa T7 analizada por microscopía de fluorescencia para asignar las células GFP-positivas cultivadas en discos zafiro estampados, 24 h después de la transfección con el plásmido pTM_AH-D1-GFP. Imagen de (B) el mayor aumento de una sola celda seleccionada dentro del rectángulo de puntos blanco para ser analizadas por CLEM. (C) imagen TEM de una sección ultrafina de la misma célula después de HPF, FS e incrustación de resina. (D) representación esquemática de las secciones seriales 70 nm ultrafinas en una cuadrícula de ranura EM que contiene la celda de interés. (E) a la izquierda: descripciones TEM de dos secciones de la célula de interés. A la derecha: imágenes TEM de alta ampliación de las áreas intracelulares seleccionadas en rectángulos amarillos a la izquierda, revelando un número elevado de vesículas delimitadas desde el citosol a través de una sola membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La metodología de CLEM presentada aquí para estudiar el impacto de una expresión de la proteína viral en las membranas celulares se ha utilizado con éxito antes de dilucidar el VHC asociados de replicación de las estructuras, principalmente²¹de la vesículas (DMV) de doble membrana, así como determinar los bloques de edificio crítico requeridos para formar estas estructuras HCV-inducido²³. Tenga en cuenta que en nuestro primer trabajo con CLEM para el estudio de la replicación del VHC²¹, se aplicó una versión ligeramente modificada del protocolo descrito aquí. En ese estudio, discos zafiro grueso convencional 0.05 mm, sin patrón alfanumérico, se utiliza en el que un patrón de referencia fue creado por carbón capa con una cuadrícula de buscador en la parte superior (véase Tabla de materiales). Esta versión del actual protocolo puede eventualmente aplicar, con la ventaja que el “Un” portador de HPF puede utilizarse directamente, sin necesidad de cortar hacia abajo como en la figura 3A. Por otra parte, como se menciona en el protocolo, un más grueso “A” portador puede ser utilizado (véase Tabla de materiales) con discos zafiro estampados, sin la necesidad de un operador “B”.

Curiosamente, este protocolo se puede aplicar no sólo para estudiar muestras de BSL-1, tales como las células transfected con proteínas virales según lo descrito aquí y en otros lugares^19,23, sino también para el estudio de células infectadas por virus. Aunque trabajo con patógenos humanos está generalmente restringido a laboratorios BSL-2 y BSL-3, en algunos países es posible realizar cryo-inmovilización en estas condiciones de bioseguridad. En los BSL-2 y BSL-3 laboratorios donde no es posible, debido a las regulaciones locales o a la ausencia de una máquina de HPF vitrificación, células infectadas por virus pueden todavía prepararse utilizando este método si se realiza fijación química con aldehídos por adelantado, es decir, antes para dejar las instalaciones BSL-2 o BSL-3. Además, aldehídos que se apagará inmediatamente después de la fijación para evitar la fluorescencia, mientras que el resto del protocolo es idéntico al descrito aquí. Esta técnica puede considerarse redundante porque las células se fijan dos veces y químicamente mediante vitrificación. Sin embargo, este protocolo de fijación doble de hecho conduce a una mucho mejor preservación de la DMV HCV-inducido en comparación con el DMV en células sometidas a fijación química solo²¹.

Para más modificaciones y resolución de problemas el lector es referidos a las notas a lo largo de la parte de protocolo de este manuscrito. Estas notas describen errores a evitar, así como las alternativas para superar posibles dificultades que pueden surgir al realizar este método.

El principal requisito para la aplicación de esta técnica es una máquina de HPF. Cuando crio-inmovilizar las células vía HPF no es factible (debido a la ausencia de una máquina de HPF) o no es necesario (cuando la preservación de la membrana no es necesario ser óptimos), las células pueden ser químicamente fijo y posteriormente preparado y analizadas por EM^{8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19}. Esta opción no requiere el uso de discos zafiro, pero platos de cultivo celular con patrones cuadriculados para la reubicación de las células o grupos de células. La principal ventaja del uso de estos platos es su diámetro más grande en comparación con discos zafiro, lo que permite la proyección de las superficies más grandes. Por lo tanto, la aplicación de este protocolo de CLEM ha sido aplicada con éxito para estudiar el efecto de un compuesto antiviral contra VHC¹⁵ o para visualizar los cambios de la membrana inducidos por las proteínas no estructurales de los norovirus¹⁹. Otra cuestión que puede limitar los resultados de este método es la ausencia de un dispositivo comercial de FS. En este caso, sistemas de FS caseros básicos pueden ser utilizados en su lugar. Aunque los dispositivos automáticos de FS podrían reducir manejo de contratiempos, dispositivos caseros se utilizan con éxito por ejemplo en laboratorios de Paul Walther y^{30 de Kent McDonald} .

Con respecto a la fijación química, el protocolo descrito aquí asegura una conservación óptima de las estructuras intracelulares²⁰. Por lo tanto, en el caso de los dispositivos mencionados de HPF y FS están disponibles, vitrificado de las células de interés sería preferido.

Alternativas futuras a este enfoque de CLEM incluyen la posibilidad de utilizar este método no sólo para adquirir información 2D a nivel ultraestructural, sino también para obtener información 3D sobre la arquitectura de las membranas y organelas alteraciones causadas por virus. Los métodos EM 3D, incluyendo tomografía de electrón (ET) y ion enfocado viga-microscopía electrónica (SEM-FIB) (ampliamente descrito en²⁹), podrían aplicarse también a las células que han sido preparadas siguiendo este protocolo actual^{21, 31}. Además, 3D podría también obtenerse información en el nivel de LM, cuando se utiliza un microscopio confocal, que permite la adquisición de pilas de z. De hecho, esta opción se recomienda cuando una correlación exacta entre conjuntos de datos EM y LM es deseada (véase por ejemplo¹⁷). La información incluida en 3D z-pilas ayuda a mejorar la correlación con las imágenes 2D de TEM. Así, en tal escenario, el mejor montaje de imágenes EM y LM puede ser seleccionado y después sometido a uno de los software de correlación disponible, por ejemplo el plugin de CE-CLEM de ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)³² o el plugin de las correspondencias de la señal de Imagen J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), resultando en la generación de imágenes de LM-EM se superponen.

Cuando la información temporal es necesario para comprender la cinética de un determinado evento, proyección de imagen de Time-lapse puede utilizarse para monitorear la dinámica de las células vivas en combinación con EM. Durante el evento de interés, las células se fijan inmediatamente, generando una “instantánea congelada” que puede ser posteriormente analizada por EM, proporcionando información ultraestructural detallada sobre ese momento en el tiempo de inmovilización. Para obtener esa “instantánea inmovilizada”, después de la observación en tiempo real, las células pueden ser químicamente fijo³³ o inmovilizada de cryo⁶. Ya que muchos procesos celulares ocurren más rápidamente que los procesos de difusión de fijación química, si es posible, debe realizarse congelación ultra rápida. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las máquinas de HPF difieren en su tiempo efectivo resolución³⁴.

Además, aunque este protocolo ha sido diseñado para la fijación de las células en una resina de epoxy, las células pueden ser también incrustadas en las resinas de baja viscosidad, tales como Lowicryls, White LR o LR oro. El uso de estos medio de inclusión permite preservar la antigenicidad^35,36, así como la fluorescencia^37,38 y, por lo tanto, se utilizan sobre todo para incrustar la inmunomarcación en sección^{39 , 40} y en la sección CLEM^41,42,43,44, donde el LM se realiza después de la incrustación. Ambos enfoques (inmuno-EM y en la sección CLEM) deben ser cruciales para aquellos experimentos en que las estructuras de la característica no se pueden encontrar fácilmente mediante TEM o como control contra miscorrelation entre LM y EM señales. Así mismo, etiquetado con anticuerpos que pueden ser visualizados por ambas modalidades de imágenes (LM y EM) puede llevarse a cabo⁴⁵ para, por ejemplo, identificar células transfected en LM (la pre-inserción etapa) y alcanzar una localización mucho más exacta de la Señal GFP a través de su etiqueta específica por inmuno-EM (etapa posterior incrustación). Debe tenerse en cuenta, sin embargo, esa permeabilización se lleva a cabo antes de LM para permitir el acceso de los anticuerpos al espacio intracelular, que puede resultar en una conservación óptima de la arquitectura de la célula en el nivel de EM. Curiosamente, este protocolo está también bien adaptado para experimentos de varios colores que se logra con el uso de otras etiquetas fluorescentes, que no sean de GFP (como se muestra aquí). En conclusión, existen muchas supuestas posibilidades de adaptación de este protocolo, tanto en el LM o en los lados de la EM, según las preguntas que se están abordando. Para una completa descripción de otros protocolos alternativos el lector se refiere a^5,46. Independientemente de cómo se combinan las modalidades de microscopía, juntos el resultado es un aumento de la información, lo que nos permite comprender mejor cómo el virus y sus proteínas interactúan con sus anfitriones en la vida real.

El paso más crítico dentro de este método es la colección de secciones seriadas de las células de interés. Como se destacó en la sección de resultados representativos, esto requiere personal experto, así como mucha paciencia. Lo importante, este paso es fundamental para encontrar las células en el nivel de EM por dos razones. En primer lugar, en este tipo de protocolo de CLEM utilizando la pre-inserción LM, las coordenadas sólo son visibles en el plano de la LM y en la cara del bloque de resina después de la incrustación. Sin embargo, no serán visibles en las secciones por TEM. Por lo tanto, objetivo recortar en el bloque hacia abajo a las regiones de interés (ROIs) debe realizarse cuidadosamente con una cuchilla de afeitar para garantizar que las secciones que se obtienen posteriormente contienen las células que expresan un determinado PF. En segundo lugar, varias secciones de la “exploración” es necesaria encontrar el mejor recubrimiento entre el LM y las adquisiciones de EM. En contraste con métodos que LM se realiza en la etapa de la inclusión, en este caso el recubrimiento LM-EM no es tan preciso. La precisión baja superposición es debido a diferencias en la resolución axial entre LM y EM, contracción durante el procesamiento de la muestra de EM y la compresión durante el seccionamiento⁴². Sin embargo, métodos de seguimiento eficiente, como el uso de lugares de interés, ayudan a encontrar las células detrás. Esto incluye la posición de una celda a otra, así como la forma de las células y su núcleo. En este sentido, como se explica en el protocolo, DIC imágenes proporcionan información “anatómica” de las células que son fundamentales para mejorar la correlación. Alternativamente, los núcleos u otros orgánulos celulares así reconocible (como las mitocondrias o lípido gotitas) puede ser teñido antes de LM y utilizado como puntos de referencia.

Por último, cabe mencionar que aunque este manuscrito se centra en el uso de esta técnica para estudios de virología, puede ampliarse el alcance de este diseño experimental para abordar cuestiones biológicas más generales.

Materials

UV Crosslinker	Stratagene	400072	Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.
Patterned sapphire discs	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	627	They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Slim and long tweezers	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72919-SS	"Style SS", for handling sapphire discs.
Cell culture medium	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	41965-062	Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 µg streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	25030-123	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Nonessential amino acids	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11140-068	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140-163	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA	F7524	Bottle of 50 ml.
Inverted microscope	Olympus Deutschland, Hamburg, Germany	CKX41	It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.
Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase	Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory	Not available	Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent	Mirus Bio LLC, Madison, USA	MIR 2304	Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.
Inverted widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany	Zeiss Observer.Z1	Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.
1-hexadecene	Merck, Darmstadt, Germany	8220640100	Bottle of 100 ml.
"A" aluminium holders for high pressure frezing (HPF)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	241	This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"B" aluminium holders for HPF	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	242	This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"A" aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	737	This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a "B" holder or the edition of the "A" holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Sapphire discs	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	405	These sapphires discs are the "conventional" one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.
Finder grids	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA	LF135-Cu	These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on "conventional" sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.
HPF machine	ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland	HPM 01	This HPF machine has been used for this protocol.
HPF machine	Leica Microsystems, Vienna, Austria	EMPACT 2	"EMPACT 2", as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).
Cryo-tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Z763667-500EA	For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.
Liquid nitrogen dewar	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany	GZ-05094-60	For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.
Automatic freeze substitution (AFS) machine	Leica Microsystems, Vienna, Austria	EM AFS2	This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.
Osmium tetroxide (OsO4)	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	19150	4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.
Uranyl-Acetate (UA)	Serva, Heidelberg, Germany	77879.01	Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.
Sonicator	Bandelin Electronic, Berlin, Germany	329	"Sonorex Super RK 31" is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.
Glass-distilled acetone	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	10015	Bottle of 100 ml.
Stereomicroscope	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica M80	Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.
Epoxy resin	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	14120	Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.
Flow through rings	Leica Microsystems, Vienna, Austria	16707157	Package containing 100 pieces.
Reagent baths	Leica Microsystems, Vienna, Austria	16707154	Package containing 100 pieces.
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica EM UC7	Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.
Ultra 35° diamond knife	Diatome Ltd., Nidau Switzerland	AGG339-735	This knife have an edge length of 3 mm.
Ultra fine tweezers	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	E78318	"Style 3X", for handling EM grids.
EM slot grids	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	G2010-Cu	100 grids/vial.
EM grid storage box	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	71155	It has capacity for 100 grids.