Bağdaşık ışık elektron mikroskobu (CLEM) yöntemi daha önce ışık mikroskobu (LM) tarafından seçilen hücrelerdeki görüntü virüs kaynaklı hücre içi yapılar elektron mikroskobu (EM) yoluyla uygulanır. LM ve EM virüs ana bilgisayar etkileşimlerin tümleşik bir görünüm elde etmek için hibrid görüntüleme yaklaştıkça birleştirilir.
Yüksek çözünürlüğü nedeniyle, elektron mikroskobu (EM) tavsiyesine için vazgeçilmez bir araçtır. Ancak, bir virüs bulaşmış veya transfected hücre EM ile analiz ederken ana zorluklar enfeksiyon veya bu hücreler incelenmesi engelleyen transfection, düşük verimleri vardır. Bu zorluk üstesinden gelmek için ışık mikroskobu (LM) ilk enfekte veya transfected hücre subpopulation ayırmak için gerçekleştirilebilir. Böylece, floresan proteinler (FPs) kullanımı yararlanarak için viral proteinler erimiş, LM burada “pozitif transfected” hücre konumları kaydetmek için bir FP ifade ve bir destek alfasayısal bir deseni üzerinde büyüyen kullanılır. Daha sonra hücreleri daha fazla EM için (HPF) buz gibi yüksek basınç işlenmesi, ikame (FS) ve reçine katıştırma dondur. Ultra hızlı dondurucu adım sonra ultrastructural düzeyinde iletim elektron mikroskobu (TEM) tarafından analiz edilebilir seçili hücrelerin mükemmel membran koruma sağlar. Burada, numune hazırlama, görüntüleme ve korelasyon ayrıntılı olarak açıklayan adım adım bağdaşık ışık elektron mikroskobu (CLEM) iş akışı sağlanır. Deneysel tasarım birçok hücre biyoloji soruları gidermek uygulayabilirsiniz.
Belirli bir biyolojik süreç daha iyi bir resim elde etmek için iki mikroskobu yöntemleri birleştirerek fikri oldukça eskidir. Böylece, ilk çalışma “bağdaşık mikroskopi” kullanarak virüsler hakkında iki ayrı yayınları1,2olarak 1960 yılında yayımlandı. Bu çalışmada yazarlar tarafından adenovirüse bakın iki mikroskobu teknikleri ile indüklenen çekirdeği morfolojisi değişimler analiz. İlk yayında adenovirus enfeksiyonu ile ilişkili morfolojik ayrıntıları açıklayan elektron mikroskobu (EM) gözlemler bildirilen1vardı. İkinci bir yayında EM tarafından gözlenen farklı yapıları ışık mikroskobu (LM) görüntüleri daha önce EM2tarafından gözlenen yapıları doğası tanımlamak için histochemical boyama desenleri ile ilişkili.
Erken bu çalışmalarda, ancak, gözlemlerinde bağımsız deneyler hazırlanan farklı enfekte hücreleri kullanılarak yapıldı. “İlişki” gerçekten de, iki görüntüleme yöntemleri gelen bilgileri birleşimi olarak farklı deneyleri ile belirli bir biyolojik anlamak için elde edilmiştir tüm bulguları karşılaştırarak bir belirli fenomeni anlamaya içindi işlem.
Günümüzde, terim bağdaşık mikroskobu, olarak da bilinen bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), ile ortak yöntemleri (gözden başvuruları3,4,5‘ te), giderek artan sayıda uygulanır Her iki görüntüleme teknikleri (LM ve EM) aynı örnek üzerinde yapılmaktadır ki. Her iki yöntem kombinasyonu, böylece, bu örnek3bir multi-modal, çok ölçekli ve çok boyutlu analiz sonuçları. LM bir protein veya proteinler türdeş olmayan hücre nüfus içinde ilgi ifade hücre altgrupları tanımlamasını sağlayan birçok farklı hücre, geniş bir bakış sağlamak gibi avantajları vardır. EM LM, belirli bir hücre içi olay bir yüksek çözünürlüklü görüntü sağlayan çözünürlük sınırının üstesinden gelir. Ayrıca, EM floresan hücre altı içeriğinin tüm bağlı membran organelleri, büyük makromoleküllerin kompleksleri (Örneğin, ribozom, centrioles, vb) ve hücre iskeleti elemanları, böylece gibi görselleştirme sağlar sözde “boşluk” başvuru”6, ek mekansal bilgi sağlamak ve bağlam LM tarafından algılanan floresan noktaya.
Son yıllarda, CLEM sadece hücre biyologları5için aynı zamanda (başvuru7‘ gözden) tavsiyesine için güçlü bir araç haline gelmiştir başarılı virüs yayma kurşun karmaşık virüs-hücre etkileşimleri anlamaya istekli. Böylece, nasıl virüsler hücre ve organelleri kendi çıkarları için değiştirmek anlama patojenik virüsleri ortadan kaldırmak için antiviral ilaçlar geliştirmek için gerekli olduğunu.
Burada, CLEM yöntemi algılanmasını sağlayan LM viral proteinler floresan bir protein (FP) erimiş ifade hücre tarafından açıklanmıştır. Bu hücreler daha sonra soguk immobilize ve daha fazla ultrastructural analiz üzerinden iletim elektron mikroskobu (TEM) nasıl bu proteinler ifade yeniden düzenlemek hücre içi membranlar (Şekil 1) içine yeni ilgili bilgi sahibi olmak için hazırlanmış. CLEM tarihi8,9,10,11,12,13için,14 yayınlandı Viroloji çalışmaların en kimyasal olarak sabit hücreleri ile sahne aldı ,15,16,17,18,19. Bu esas olarak seviye-2 ve cryo-immobilizasyon hücre genellikle mümkün olmadığı-3 (BSL-2 ve BSL-3) laboratuvarları, Biyogüvenlik nedenlerle bulaşıcı malzeme ihracı ihtiyacı kaynaklanmaktadır. Hücre zarları en uygun bir koruma gerektiren bu soruları için Vitrifiye (HPF) buz gibi yüksek basınç yoluyla ancak,20önerilir. Bu gibi durumlarda, burada açıklanan CLEM iletişim kuralı uygulanır. İlginçtir, özellikle bulaşıcı örnekleri ile çalışırken, HPF örneğin BSL-2 ve BSL-3 laboratuvarlarda daha önce kimyasal Inaktif yapıyor örnekleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Kimyasal fiksasyonu HPF tarafından takip en azından kısmen cryo-koruma yöntemleri21,22avantajları kar için bir olasılık birleşimidir.
Resim 1 : Hücreleri çözümlenmesi için iş akışının şematik Gösterim CLEM. Desenli Safir diskler üzerinde büyüyen hücreler ilk FPs EM için onların işlemeden önce ifade hücreleri yerelleştirmek için LM tarafından incelenir. Bir kez yer alan hücreleri hemen HPF ve FS daha sonra reçine gömmeye sabitlenir. Polimerizasyon reçine, nerede hücreleri büyüyen destek üzerine (Safir diskler =) reçine bloğundan kaldırılması gerekir. Katıştırılmış hücreleri içeren blok içinden bir elmas bıçak ile FPs, ifade kalan hücreleri kesitli küçük bir yamuk için kırpılır. Ultrathin bölümleri yuvası ızgaralar üzerinde toplanan ve daha fazla bu hücreler ultrastructural bilgilerini elde etmek için TEM tarafından incelenir. Bu rakam uyarlanmış ve izni başvuru29ile değiştirilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Burada bir viral protein ifade hücre zarı üzerinde etkisini incelemek için sunulan CLEM metodoloji başarıyla çoğaltma ilişkili HCV aydınlatmak için yapıları, esas olarak çift cidarlı veziküller (DMVs)21, önce hem de kullanılmıştır Bu yapıları HCV kaynaklı23oluşturmak için gerekli kritik yapı taşları belirlemek. HCV çoğaltma21çalışmaya CLEM kullanarak ilk çalışmalarda dikkat edin, biraz değiştirilmiş sürüm burada açıklanan protokolü uygulandı. Çalışma, alfasayısal desen, olmadan geleneksel 0.05 mm kalın Safir diskler kullanılmış o içinde başvuru desen tarafından yaratıldı onları Bulucu kılavuz üstünde tepe ile kaplama karbon ( Tablo malzemelerigörmek). Bu sürümü geçerli protokol, sonunda, “Bir” taşıyıcı HPF için doğrudan, Şekil 3olduğu gibiAazaltmayı gerek kalmadan kullanılabilir avantajı ile uygulanabilir. Alternatif olarak, iletişim kuralında belirtildiği gibi bir daha kalın “A” taşıyıcı yararlı olabilir ( Tablo malzemelerigörmek) bir “B” taşıyıcı, gerek kalmadan desenli Safir diskler ile.
İlginçtir, bu protokolü sadece hücreleri açıklandığı gibi viral proteinler ile burada ve başka yerlerde19,23transfected gibi BSL-1 örnekler, incelemek için aynı zamanda virüs bulaşan hücreleri incelemek için uygulanabilir. İnsan patojenler ile çalışma BSL-2 ve BSL-3 laboratuvarları için genellikle sınırlı olsa da, bazı ülkelerde cryo-immobilizasyon bu Biyogüvenlik koşullar altında gerçekleştirmek hala mümkündür. Bu BSL-2 ve vitrifiye yerel düzenlemelere veya bir HPF makine yokluğu nedeniyle mümkün olmadığı BSL-3 laboratuvarları, virüs bulaşan hücreleri hala eğer kimyasal fiksasyonu aldehitler ile önceden yürütülen bu yöntemi kullanarak hazırlanabilir, Yani daha önce BSL-2 veya BSL-3 tesisleri bırakarak. Ayrıca, aldehitler sonra hemen fiksasyon protokol geri kalanı burada açıklanan bir aynıdır floresans tutmak için su lazım. Hücreleri iki kez, kimyasal ve vitrifiye üzerinden sabit çünkü bu teknik gereksiz düşünülebilir. Ancak, bu Çift Kişilik fiksasyon Protokolü gerçekten HCV kaynaklı DMVs kimyasal fiksasyonu yalnız21‘ e tabi hücreleri bulundu DMVs ile karşılaştırıldığında bir daha fazla korunması yol açar.
Daha fazla değişiklikler ve okuyucu sorun giderme için bu el yazması Protokolü parçası boyunca notlar için denir. Bu notları tuzaklar önlemek için hem de bu yöntem işlemi sırasında ortaya çıkabilecek sözde zorlukları aşmak için alternatifler açıklar.
Bu tekniği uygulamak için ana koşul HPF makinesidir. Ne zaman cryo-immobilizing HPF yoluyla hücreleri (bir HPF makine devamsızlık nedeniyle) mümkün değildir ya da ne zaman (membran korunması en uygun olması gerekli değil) gerekli değildir, hücreleri olabilir kimyasal olarak sabit ve daha sonra hazırlanan ve EM8tarafındananaliz, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. Bu seçenek hücre kültür yemekleri gridded desenlerle hücreleri veya hücre kümeleri yeniden konumlandırma için ama Safir diskler kullanımı gerektirmez. Bu yemekler kullanımı en büyük avantajı onların daha büyük çapı ile karşılaştırıldığında daha büyük yüzey alanlarını tarama izin Safir diskler olduğunu. Böylece, bu CLEM iletişim kuralı uygulaması HCV15 karşı antiviral bir bileşik etkisini incelemek için veya noroviruses19mekansal proteinler tarafından indüklenen membran düzenlemeler görselleştirmek için başarıyla uygulandı. Bu yöntemin performansı sınırlayabilir bir başka konu ticari bir FS aygıtı olmaması. Bu durumda, temel ev yapımı FS sistemleri yerine kullanılabilir. FS otomatik işleme aksilikler azaltabilir olmasına rağmen ev yapımı aygıtları başarıyla örneğin Kent McDonald’s30 ve Paul Walther’ın laboratuarda kullanılıyor.
Kimyasal fiksasyonu ile ilgili olarak burada açıklanan protokol hücre içi yapılar20en iyi bir koruma sağlar. Bu nedenle, yukarıda belirtilen HPF ve FS aygıtları mevcut olduğu durumlarda faiz hücrelerinin viktifiye tercih olacaktır.
Gelecekteki seçimli-e doğru bu CLEM yaklaşım sadece ultrastructural düzeyde 2D bilgi almak için aynı zamanda zar ve organel değişiklik virüslerin neden mimarisi hakkında 3D bilgi elde etmek için bu yöntemi kullanma imkanı bulunmaktadır. Elektron tomografi (ET) ve odaklanmış iyon demeti Tarama elektron mikroskobu (FIB-SEM) (yoğun açıklandığı29), dahil olmak üzere 3D-EM yöntemleri de bu geçerli protokol21takip hazırlanan hücrelere uygulanabilir, 31. Buna ek olarak, 3B bilgileri de LM düzeyinde z-yığınlar edinimi sağlar confocal mikroskop kullanarak elde. Aslında, LM ve EM veri kümeleri arasında kesin bir bağlantı istenen (bkz. Örneğin17) olduğunda bu seçenek önerilir. 2B TEM görüntüleri ile ilişki geliştirmek için 3D z-yığınlar AIDS yer alan bilgiler. Bu nedenle, böyle bir senaryoda, LM ve EM görüntüleri uygun en iyi seçilebilir ve sonra bir korelasyon yazılım mevcut, ec-CLEM eklenti Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 veya Landmark yazışmalar eklentinin gibi tabi Resmi J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), LM-EM görüntüleri örtüşen nesilde kaynaklanan.
Belirli bir olay kinetik anlamak için geçici bilgi gerektiğinde, hızlandırılmış görüntüleme canlı hücreler EM ile birlikte dinamikleri izlemek için kullanılabilir. Faiz olay sırasında hücreler hemen, giderilen “daha sonra EM yolu ile çözümlenebilir bir donmuş anlık görüntü”, immobilizasyon saat o anda hakkında ayrıntılı ultrastructural bilgi. Bu “dondurulmuş anlık görüntü”, gerçek zamanlı gözlem sonra elde etmek için kimyasal olarak sabit33 veya6cryo immobilize hücreler olabilir. Birçok hücresel süreçler kimyasal fiksasyonu difüzyon süreçlerinin daha hızlı oluşur, mümkünse, ultra hızlı donma gerçekleştirilmesi gerekiyor. Ancak, HPF makineleri onların etkili zaman çözünürlük34farklı dikkate almak önemlidir.
Bu iletişim kuralı hücrelerinin bir epoksi reçine gömmek için tasarlanmış olmasına rağmen Ayrıca, hücreleri de düşük viskozite reçineler, Lowicryls, LR beyaz veya LR altın gibi içinde gömülü olabilir. Bu gömme medya kullanımı floresans37,38 yanı sıra antigenicity35,36korumak için olanak sağlar ve bu nedenle, çoğunlukla bölüm immunolabeling39 sonrası gömmek için kullanılır , 40 ve gömme sonra Şampiyonlar Ligi nerede yapılır bölüm CLEM41,42,43,44. Her iki yaklaşımın (IMMUNO-EM ve bölüm CLEM) hangi özelliği olmayan yapıları kolayca yolu ile TEM ve/veya miscorrelation LM ve EM arasında karşı kontrol olarak sinyalleri bulunabilir bu deneylerin için çok önemli olmalı. Aynı şekilde, iki görüntüleme yöntemleri (LM ve EM) tarafından görüntülenmiştir antikorlar ile etiketleme Örneğin, (sahne öncesi katıştırma) LM transfected hücreleri tanımlamak ve çok daha doğru bir yerelleştirme elde etmek için45 yapılabilir Onun belirli IMMUNO-EM tarafından (sonrası gömme sahne) etiketleme yoluyla GFP sinyal. Dikkate alınması gereken, ancak, o permeabilization LM antikorlar hücre mimarisi EM düzeyinde alt-optimal korunması neden olabilir hücre içi alanı erişime izin vermek için önce yapılır. Çok renkli bu deneyler için ilginç bir şekilde, bu iletişim kuralını da son derece uygundur GFP dışındaki Diğer Floresan Etiketler kullanımı ile (burada görüldüğü gibi) elde edilebilir. Sonuç olarak, bu iletişim kuralı, hem Şampiyonlar Ligi ve/veya EM tarafta bağlı olarak ele alınmaktadır sorular adapte birçok sözde olasılık vardır. Diğer alternatif iletişim kuralları kapsamlı açıklaması için5,46için okuyucu denir. Mikroskopi yöntemleri nasıl birleştirilir ne olursa olsun, birlikte bir kazanç daha iyi virüs ve onların protein gerçek hayatta onların ailelerle etkileşimini anlamak izin verdiğiniz bilgilerin sonucudur.
Bu yöntem içinde en önemli adım faiz seri bölümler hücrelerinden koleksiyonudur. Temsil edici sonuçlar bölümünde vurgulanan, bu uzman kadrosu, hem de sabır gerektirir. Önemlisi, bu adımı iki nedenden dolayı geri EM düzeyinde hücreleri bulmak için önemlidir. İlk olarak, LM önceden katıştırma CLEM iletişim kuralı’nı bu sıralamada, koordinatları yalnızca LM düzeyinde ve reçine blok yüzündeki gömme sonra görülebilir. Ancak, onlar tarafından TEM bölümlerinde görünür olmaz. Bu nedenle, hedeflenen kesme blok yüzünde faiz (ROIs) bölgelerinde daha sonra elde edilen bölümleri belirli bir FP ifade hücreleri içerir emin olmak için bir jilet ile dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. İkinci olarak, “birkaç bölüm tarama” Şampiyonlar Ligi ve EM satın almalar arasında en iyi yer paylaşımı bulmak gereklidir. LM sonrası gömme aşamada yapılacağı yeri yöntemleri aksine, bu durumda LM-EM kaplama kadar kesin değildir. Düşük bindirme doğruluk Aksiyel çözünürlük LM ve EM, Em örnek işleme sırasında büzülme ve sıkıştırma sırasında42kesit arasındaki farkları kaynaklanmaktadır. Yine de, tarihi yerler, kullanımı gibi etkili izleme Yöntemler geri hücreleri bulmak için yardımcı olur. Bu başka bir bir hücrenin konumu, hem de hücreleri ve onların çekirdek şekli içerir. Bu bağlamda, iletişim kuralında açıklandığı, DIC görüntüleri korelasyon geliştirmek için kritik olan hücreleri “anatomik” bilgi sağlar. Alternatif olarak, çekirdekleri veya diğer iyi tanınabilir hücre organelleri (mitokondri veya lipid damlacıkları) LM önce lekeli ve Simgesel kullanılan.
Son olarak, her ne kadar bu el yazması bu tekniğin kullanımı Viroloji etütler odaklanmıştır, bu deneysel tasarım kapsamını daha genel biyoloji soruları gidermek için Genişletilebilir olduğunu belirtmeyi çekicidir.
The authors have nothing to disclose.
Personeli, elektron mikroskobu çekirdek özellikleri (EMCF) EMBL (Heidelberg) ve University of Heidelberg için minnettarız. Biz de teşekkür Ulrike Herian, Stephanie Kallis ve Andrea Hellwig (Heidelberg Üniversitesi), yanı sıra Eberhardt Schmidt ve Renate Kunz (Ulm Üniversitesi) uzman teknik destek için istiyorum. R.B. eseri ve ekibi (U.H. ve kızıl ötesi-b) Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 ve TRR83, TP13 tarafından desteklenen.
UV Crosslinker | Stratagene | 400072 | Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each. |
Patterned sapphire discs | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 627 | They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch. |
Slim and long tweezers | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72919-SS | "Style SS", for handling sapphire discs. |
Cell culture medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 41965-062 | Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 µg streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each. |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25030-123 | Package containing 20 bottles of 100 ml/each. |
Nonessential amino acids | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11140-068 | Package containing 20 bottles of 100 ml/each. |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140-163 | Package containing 20 bottles of 100 ml/each. |
Fetal calf serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA | F7524 | Bottle of 50 ml. |
Inverted microscope | Olympus Deutschland, Hamburg, Germany | CKX41 | It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability. |
Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase | Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory | Not available | Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de. |
Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus Bio LLC, Madison, USA | MIR 2304 | Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml. |
Inverted widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany | Zeiss Observer.Z1 | Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures. |
1-hexadecene | Merck, Darmstadt, Germany | 8220640100 | Bottle of 100 ml. |
"A" aluminium holders for high pressure frezing (HPF) | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 241 | This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch. |
"B" aluminium holders for HPF | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 242 | This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch. |
"A" aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs) | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 737 | This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a "B" holder or the edition of the "A" holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch. |
Sapphire discs | Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland | 405 | These sapphires discs are the "conventional" one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs. |
Finder grids | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA | LF135-Cu | These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on "conventional" sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial. |
HPF machine | ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland | HPM 01 | This HPF machine has been used for this protocol. |
HPF machine | Leica Microsystems, Vienna, Austria | EMPACT 2 | "EMPACT 2", as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above). |
Cryo-tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Z763667-500EA | For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials. |
Liquid nitrogen dewar | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | GZ-05094-60 | For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes. |
Automatic freeze substitution (AFS) machine | Leica Microsystems, Vienna, Austria | EM AFS2 | This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins. |
Osmium tetroxide (OsO4) | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 19150 | 4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules. |
Uranyl-Acetate (UA) | Serva, Heidelberg, Germany | 77879.01 | Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O. |
Sonicator | Bandelin Electronic, Berlin, Germany | 329 | "Sonorex Super RK 31" is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium. |
Glass-distilled acetone | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 10015 | Bottle of 100 ml. |
Stereomicroscope | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica M80 | Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images. |
Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 14120 | Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers. |
Flow through rings | Leica Microsystems, Vienna, Austria | 16707157 | Package containing 100 pieces. |
Reagent baths | Leica Microsystems, Vienna, Austria | 16707154 | Package containing 100 pieces. |
Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica EM UC7 | Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature. |
Ultra 35° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau Switzerland |
AGG339-735 | This knife have an edge length of 3 mm. |
Ultra fine tweezers | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | E78318 | "Style 3X", for handling EM grids. |
EM slot grids | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | G2010-Cu | 100 grids/vial. |
EM grid storage box | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 71155 | It has capacity for 100 grids. |