Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Kvantifiera växt lösligt Protein och lättsmält kolhydrat innehåll, med hjälp av majs (Zea mays) som ett föredöme

Published: August 6, 2018 doi: 10.3791/58164
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 2, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Entomology, University of Minnesota, 3Department of Entomology, University of Kentucky

Summary

De protokoll som beskrivs häri ger en tydlig och lättillgänglig metod för mätning av lösligt protein och lättsmält (icke-strukturella) kolhydratinnehållet i växt vävnader. Möjligheten att kvantifiera dessa två växt makronäringsämnen har betydande konsekvenser för framflyttning områdena växtfysiologi, näringsmässiga ekologi, växt-herbivor interaktioner och mat-web ekologi.

Abstract

Elementär data används ofta att härleda växt kvalitet som en resurs för växtätare. Men begränsa gränslösa av kol i biomolekyler, förekomsten av kvävehaltiga växt defensiva föreningar och variation i artspecifika korrelationer mellan kväve och växt proteinhalt alla riktigheten av dessa slutsatser. Dessutom forskning inriktad på anläggningen eller växtätare fysiologi kräver en nivå av noggrannhet som inte uppnås med generaliserad korrelationer. De metoder som presenteras här ger forskare en tydliga och snabba protokoll för direkt mätning av lösliga växtproteiner och lättsmälta kolhydrater, två växt makronäringsämnen mest nära knuten till djurens fysiologiska prestanda. Protokollen kombinera väl karakteriserade kolorimetriska analyser med optimerad anläggningsspecifika matsmältningen steg att ge exakta och reproducerbara resultat. Våra analyser av olika sockermajs vävnader visar att dessa analyser har känsligheten att upptäcka variation i växt lösligt protein och lättsmält kolhydrat innehåll över flera rumsliga skalor. Dessa inkluderar mellan-växt skillnader över växande regioner och arter eller sorter, liksom inom-växt skillnader i vävnadstyp och även positionella skillnaderna inom samma vävnaden. Att kombinera lösligt protein och lättsmält kolhydrat innehåll med elementärt data har också potential att ge nya möjligheter i växtbiologi ansluta Mineralisk växtnäring med växt fysiologiska processer. Dessa analyser hjälper också generera lösligt protein och lättsmält kolhydrat-data som behövs för att studera näringsmässiga ekologi, växt-herbivor interaktioner och näringsväv dynamik, som i sin tur kommer att förbättra fysiologi och ekologisk forskning.

Introduction

Växtbiomassa utgör grunden för nästan alla landlevande födovävar. Växter förvärva näringsämnen från marken genom sina rötter-system och utnyttja solljuset i sina foliar vävnader att syntetisera biomolekyler. I synnerhet kol och kväve används för att skapa kolhydrater, proteiner (som består av aminosyror) och lipider som behövs för att bygga anläggningen biomassa (det bör noteras att i växt fysiologi den termen ”macronutrient” ofta hänvisar till jord element, såsom N, P, K och S, men kommer i hela detta dokument denna term se biomolekyler, som proteiner, kolhydrater och lipider). När växtätare konsumerar växtmaterial, makronäringsämnen som finns i växt vävnader bryts ner i sina beståndsdelar och sedan används för att driva de fysiologiska processerna av konsumenten. På detta sätt har växt makronäringsämnen en stark påverkan på konsumenten fysiologi tillsammans med viktiga konsekvenser för högre ordning ekologiska interaktioner och mat-web dynamics.

Över hela djurriket är lösligt protein och smältbara kolhydrater makronäringsämnen mest nära knuten till överlevnad, reproduktion och prestanda1. Dessutom reglera majoriteten av djur aktivt sitt intag av makronäringsämnen två att möta deras fysiologiska krav1,2. Detta är särskilt sant för insekt växtätare som upptäcka koncentrationerna av sockerarter och aminosyror i växt vävnader, som i sin tur styr utfodring beteende. Som ett resultat, plantera lösligt protein och lättsmält kolhydratinnehållet har spelat en stor roll i utvecklingen av växt-insekt interaktioner.

Även uppgifter om anläggningen lösligt protein och lättsmält kolhydrat innehåll är relativt sällsynta (men se6,7,8,9,10,11), finns det en övervikt av tillgängliga data om anläggningen elementärt innehåll (kol, kväve och fosfor). Till stor del detta beror på att elementen har en primär roll i växt Mineralisk näring3,4,5. Där element mäts, korrelationer har använts för att extrapolera mängden lösligt protein och lättsmälta kolhydrater, men exakta beräkningar är ofta svårt att få. Det är exempelvis omöjligt att använda kol som en indikator på anläggningen lättsmält kolhydratinnehållet eftersom kol finns ubiquitously i alla organiska föreningar. En starkare relation mellan elementärt kväve och växt lösligt proteininnehåll och generaliserad kväve-till-protein konverteringsfaktorer änvänds ofta. Det finns dock starka bevis för att kväve-till-protein konverteringar är mycket artspecifika12,13,14,15, gör användningen av generaliserad konvertering sannolikt felaktig. På grund av detta saknar kväve-till-protein konverteringsfaktorer ofta precision, särskilt i den utsträckning som krävs för näringsmässiga studier på växtätare. Dessutom kan förekomsten av N-innehållande växt allelochemicals, såsom alkaloider och Glukosinolater som ofta är giftiga för växtätare, blanda ihop dessa konverteringar.

Här erbjuder vi två kemiska analyser för att mäta koncentrationen av lösliga proteiner och smältbara kolhydrater i växt vävnader. Dessa analyser redovisas separat, men det föreslås att de användas samtidigt att analysera de samma växtprover för att uppnå en mer omfattande analys av växten makronäringsämnen. Båda använder liknande metoder, som består av en extraktion steg, följt av kvantifiering via absorbans. Anläggningen prov prep är också identiska för båda protokollen, vilket gör det enkelt att köra båda analyser i tandem. Nyttan av dessa analyser inte uppstår ur sin nyhet, eftersom de bygger på äldre, (Bradford, Jones, Dubois) väletablerade kolorimetriska analyser16,17,18, men här har vi organiserat en tydlig och lätt att följa protokoll som kombinerar dessa metoder med mer obskyra anläggningsspecifika utvinning tekniker17,19 för att göra tillämpningen av dessa analyser mer tillgängliga för de i växt-relevanta fält.

För båda analyser extraheras växt makronäringsämnen först fysiskt genom frysning, frystorkning och slipning växtmaterial. För lösligt protein analysen, ytterligare sker kemisk extraktion17,19 genom flera rundor av vortexa och värme prover i NaOH-lösning. Den välkända Bradford assay, utnyttja Coomassie brilliant blue G-250, används för att kvantifiera lösliga proteiner och polypeptider mellan 3,000-5,000 Dalton16,17. Denna analys har ett detektionsområde mellan 1-20 µg totalt proteiner per mikroplattan väl eller < 25 µg/mL, men inte inte mäta fria aminosyror. Steget utvinning av lättsmält kolhydrat analysen är baserad på metoden för utspädd syra av Smith et al. 20 och tillåter för isolering av lösliga sockerarter, stärkelse, och fructosan – men inte strukturella kolhydrater. En fenol-sulfuric syra kvantifiering metod tas från Dubois et al. 18 och mäter alla mono-, oligo- och polysackarider (samt metyl derivat). Denna analys är kunna kvantifiera specifika sockerarter, men här använder vi det som en indikator på totala lättsmält kolhydrat innehåll (se Smith et al. 20 för mer detaljerad analys). Tillsammans, mäta dessa analyser två makronäringsämnen som är starkt bundna för att plantera eco-fysiologi och växtätare prestanda, med viktiga uppgifter om resurs kvalitet vid basen av terrestrial näringsvävar. Presentera dessa protokoll främjar generering av växten macronutrient datamängder för att erhålla en mer grundlig förståelse av växtfysiologi, växtätare näringsmässiga ekologi och växt-herbivor interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. växtskyddsmedel insamling och bearbetning

  1. Samla in och bearbeta växtprover
    1. Efter att samla in växtprover, flash-frysa prover genom doppning växtmaterial i flytande kväve med pincett och förvaras vid-80 ° C. Om växten proverna samlas in är för stora flash-frysa och snabbt coola proverna använda torris och överföring till-80 ° C frys så snart som möjligt. Macronutrient innehållet av växtmaterial kan ändra efter vävnader är åtskilda från anläggningen, så det är viktigt att frysa växtprover så snart som möjligt efter samlingen.
      Varning: Flytande kväve kan orsaka svåra köldskador vid kontakt med huden. Kontrollera att transportera flytande kväve i godkänd behållare och bära lämplig personlig skyddsutrustning under sin hantering, inklusive cryo-handskar, ögat googles, ansiktsmask, förkläde och en labbrock.
    2. Lyophilize växtmaterial med en frystork för att garantera att vävnader är metaboliskt inaktiva medan vatten tas bort. Torr tills massan av provet stabiliserar för att säkerställa allt vatten har tagits bort.
    3. När prover är torr, slipa till ett fint pulver med hjälp av en kvarn eller kvarn. Lagra prover i ett desiccating skåp fram till analys.

2. lösligt Protein Assay

  1. Provberedning
    1. Väg upp identiska prover av varje vävnad, cirka 20 mg vardera, i 1,5 mL polystyren mikrocentrifugrör och etikett rör. Dessa prover kommer därefter betecknas som okända prover. Spela in exakta massan av varje prov, som denna information kommer att vara skyldiga att beräkna % lösligt protein i varje okänt prov. Använda mikrocentrifugrör med låsbara lock, som icke-låsande lock kan öppna under efterföljande värme steg, vilket resulterar i förlust av provlösningen.
  2. Solubilize och isolera okänt prov proteiner
    1. Micro-vi rekommenderar att en Lägg till 500 µL 0,1 M NaOH till varje rör. Stäng locken tätt och Sonikera i 30 minuter. Värm en varmvatten bad 90 ° C.
      Varning: Natriumhydroxid är en stark bas och kan orsaka brännskador vid kontakt med huden. Även om 0,1 M NaOH representerar en låg koncentration, Använd skyddshandskar för att undvika hudirritation.
    2. Placera rören i ett rack i hett vattenbad i 15 minuter.
    3. Centrifugera rören vid 15 000 x g i 10 minuter. Pipettera dekanteringsvätskan i nya märkta mikrocentrifugrör, med en ny pipettspetsen för varje prov. Tillsätt 300 µL 0,1 M NaOH till röret som innehåller pellets och centrifugera igen vid 15 000 x g i 10 minuter. Igen, samla den supernatanta vätskan och kombinera det med andra supernatanta vätskan från samma prov. Detta är en potentiell stoppläget och prover kan lagras vid 4 ° C över natten om det behövs.
  3. Fällningen växtproteiner
    1. Neutralisera pH-värdet i supernatanten genom att lägga till 11 µL av 5,8 M HCl. Bekräfta ett pH på ~ 7 genom att doppa lackmuspapper i varje provlösning.
      Varning: Saltsyra är en starkt frätande syra som kan orsaka brännskador vid kontakt med huden (huden ansökan eller inandning). Vänligen Använd handskar för att förhindra hudirritation vid hantering av HCl.
    2. Lägga till 90 µL 100% triklorättiksyra (TCA) i varje rör och inkubera rören på isen i 30 minuter. Utfällning av proteiner blir lösningen från klart till ogenomskinlig. Om detta inte sker efter 30 minuter, kylskåp rören i 1 timme. Detta är en potentiell stoppläget och prover kan lagras vid 4 ° C över natten om det behövs.
      Varning: Triklorättiksyra är frätande. Vänligen Använd handskar vid hantering för att förhindra kontakt med hud och Undvik inandning.
    3. Centrifugera proverna på 13 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C. Ta försiktigt bort TCA supernatanten genom sugning det ut med en vakuum linje som bifogas ett glas fint mikropipett tips (samma tips kan användas över prover). Stör ej protein pelleten genom att undvika tunga sug och hålla ett lämpligt avstånd mellan pipettspetsen och pelleten.
    4. Tvätta pelleten snabbt med 100 µL av-20 ° C aceton. Detta steg tar bort eventuella återstående TCA från pelleten, som kan störa den efterföljande Bradford analysen; dock startar aceton att upplösa protein pelleten om kvar i kontakt för lång, så aceton bör läggas sedan snabbt utvinns ur pelleten inom 5 sekunder.
    5. Tillåta aceton avdunsta genom att placera rören i ett dragskåp eller kylskåp. Lös sedan, protein pelleten genom att tillsätta 1 mL 0,1 M NaOH till varje rör. Helt upplösa pelleten kan kräva flera omgångar av värme i ett hett vatten bad, vortexa och sonicating.
      Obs: Ju längre rören sitter i i dragskåp eller kylskåp och desto torrare pellets blir, desto svårare blir de att åter solubilize. Det föreslås för att torka pelleten i 30 minuter, och sedan kontrollera förekomsten av aceton varje 10-15 minuter tills det är klart att aceton har avdunstat (ingen aceton rök detekteras).
  4. Blanda standardlösningar, späd okänt prov lösningarna och kvantifiera det totala proteininnehållet i okända prover med Bradford-analys.
    1. Förbereda nötkreatur immunglobulin G (IgG) standardlösningar enligt de koncentrationer som anges i tabell 1 (frystorkade eller IgG stamlösning kan blandas med avjoniserat vatten för att uppnå varje koncentration). Lagra standarder vid 4 ° C. I en plattan med 96 brunnar, tillsätt 160 µL av varje IgG standardlösning i tre exemplar början A1 av väl plattan (0 µg/µL i A1, A2, A3 Placera, 0,0125 µg/µL i B1, B2, B3 positioner, etc.).
    2. Bereda en utspädd NaOH-lösning genom att lägga 50 µL 0,1 M NaOH till 950 µL destillerat vatten. Som en tom negativ kontroll, tillsätt 60 µL av denna lösning till väl plattan i tre exemplar (G1, G2, G3 positioner).
    3. Preparera utspädningar av okända prover genom att lägga till 50 µL av varje provlösning 950 µL destillerat vatten i en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör. Lägg sedan till 60 µL av varje utspätt prov till väl plattan i tre exemplar, början H1. En plattan med 96 brunnar bör möjliggöra analys av 6 standarder, 1 blank och 25 okända prover när läser i tre exemplar. Varje väl platta analyseras bör innehålla egna IgG standard och Tom prover.
    4. Tillsätt 100 µL destillerat vatten till alla tomma och okända prover brunnar. Nu var väl bör innehålla totalt 160 µL. med flerkanalig pipett (8 kanaler), lägga till 40 µL Coomassie brilliant blue G-250 protein färga varje väl i den första kolumnen av väl plattan. Blanda färgen med prover av störta flera gånger. Upprepa för alla andra kolumner, ersätter pipettspetsar att undvika kontaminering.
      Varning: Coomassie brilliant blue G-250 är en irriterande och kontakt med hud, ögon eller lungor bör undvikas. Vänligen Använd handskar för att förhindra kontakt med huden. Om kontakt med huden uppstår, kommer att denna produkt färga.
    5. Använda en nål för att pop alla bubblor i brunnarna, eftersom de kan störa mikroplattan spektrofotometer läsningen. Ren nålen för att undvika kontaminering mellan brunnar. Låt mikroplattan odla i rumstemperatur i 5 minuter.
    6. Med en mikroplattan spektrofotometer, registrera absorptionsvärdena för varje brunn på 595 nm.
    7. Spela in genomsnittlig absorbans för de tre tomma brunnarna och subtrahera värdet från varje standard och okända prov avläsningarna. Sedan, registrera genomsnittlig absorbans för varje standard och okända prov.
      Obs: För att beräkna mängden protein i varje okänt prov med hjälp av standardkurvan, det är enklast att regrediera genomsnittlig absorbans varje standard mot mikrogram av protein som finns i varje standard, men man kan rita protein koncentrationen (µ g/µL) av varje standard om önskvärt. Följande beräkningar, se dock en standardkurva baserat på mikrogram, inte koncentrationer (µg/µL).
    8. Rita genomsnittlig absorbans varje standard mot den totala mängden protein som finns i varje standard väl (tabell 1). Passar en linjär regressionslinje till dessa data och använda ekvationen för att beräkna mängden protein (µg) i varje okänt prov väl baserad på genomsnittlig absorbans (figur 1a).
      Obs: Korrelationskoefficienten (r -värdet) av denna linje bör vara större än 0,98 och rutinmässigt nära 0,99. Den vanliga regressionen är specifik för varje platta, därav de okända provet brunnarna i varje platta måste analyseras separat.
    9. När den genomsnittliga mängden protein beräknas för varje okänt prov brunn, använda följande ekvation för att beräkna den totala mängden protein (µg) i varje ursprungliga provet:
      Mp = (((Wp/60) x 1000) / 50) * 1000
      Mp = µg av protein i ursprungsprovet
      Wp = µg av protein i okänt prov väl
      1. Använd sedan följande ekvation för att bestämma andelen protein i varje prov:
        Pp = ((Mp/1000) /Mi) * 100
        Pp = % protein i provet
        Mjag = ursprungliga massa av provet (mg)
        Obs: I vissa fall provet kan överträffa övre absorbansen tröskeln. I så fall kan provlösning kräva ytterligare utspädning vid steg 2.4.3.
        Ytterligare utspädningar måste sedan redovisas i senare beräkningar. Vissa microplate reader märken också ge datorprogram som automatiskt beräknar den genomsnittliga proteinkoncentration av varje okänt prov baserat på standardkurvan data.

3. smältbara kolhydrater Assay

  1. Provberedning
    1. Väg upp identiska prover av varje vävnad, cirka 20 mg vardera, till glas 15 mL rör med gummi-fodrade skruvkork (längd 100 mm). Dessa prov kommer därefter betecknas som okända prover. Märk rören med en vattenfast märkpenna eller med märkning tejp på locken och spela in exakta massan av varje prov, som denna information kommer att vara skyldiga att beräkna de % kolhydraterna i varje okänt prov.
  2. Extrahera smältbara kolhydrater från varje okänt prov.
    1. Tillsätt 1 mL 0,1 M H2så4 i varje rör och skruvkork på rör tätt. Placera i kokande vattenbad i 1 timme.
      Varning: Svavelsyra är mycket frätande. Vänligen Använd handskar, ögat googles och ett förkläde vid hantering H2så4 och utföra det här steget i dragskåp.
    2. Svalka av rören i ett ljummet vattenbad. Häll tube innehållet i märkta 1,5 mL mikrocentrifugrör (inte bli orolig om några planterar materiella lämningar i glasrör!).
    3. Centrifugera rören vid 15 000 x g i 10 minuter. Ta bort den supernatanta vätskan med en mikro-vi rekommenderar och plats i nya märkta 1,5 mL mikrocentrifugrör. Rören kan förvaras i kylskåp över natten på denna punkt. Om fortsätter med analys, se steg 3.3.2.
  3. Blanda standardlösningar och kvantifiera totala lättsmält kolhydratinnehållet i okända prover.
    1. Förbereda d glukos standardlösningar med koncentrationerna som anges i tabell 2. Förbereda sex glas provrör med 400 µL av varje standardlösning.
    2. Pipettera 15 µL av varje okänt prov i egen provrör och tillsätt 385 µL destillerat vatten till varje för en total volym på 400 µL i varje provrör. I ett dragskåp, tillsätt 400 µL 5% fenol i varje standard och okända prov provrör och sedan snabbt överför med pipett 2 mL koncentrerad H2SO4 till varje rör. Tryck på provröret innehållet med pipettspetsen inte, bara lägga till lösning ytan (repeater pipett fungerar bäst för detta).
    3. Låt rören Inkubera i 10 minuter, och sedan försiktigt vortex rören för att blanda innehållet. Inkubera i ytterligare 30 minuter.
      Varning: Fenol och svavelsyra är Frätande irriterande. För att skydda från exponering för hud, ögon och inandning, detta steg bör utföras i kemiska dragskåp med ordentlig PPE, vilket inkluderar: möta sköld eller ögat skyddsglasögon, gummihandskar, lab förkläde och stövlar. Blanda fenol med svavelsyra också resultat i en exoterm reaktion, som resulterar i rören blir varma.
    4. Pipettera 800 µL prov från varje rör i varje 3 polystyren 1,5 mL semi micro kyvetter (3 tekniska replikat per prov). Ställ in spektrofotometern att läsa på 490 nm. Kalibrera till en tom kyvetten som innehåller destillerat vatten innan du läser standarder eller okända prover och periodvis under hela provet avläsningar. Kör varje kyvetten genom en spektrofotometer och registrera absorbansen. Genomsnitt över tekniska replikat för varje okänt prov.
      Obs: I vissa fall prover kan överträffa övre absorbansen tröskeln. Om så, prover ska spädas vid steg 3.2.3. Spädningar måste också redovisas i senare beräkningar.
    5. Beräkna genomsnittlig absorbans för varje standard.
      Obs: För att beräkna mängden totala smältbara kolhydrater i varje okänt prov med hjälp av standardkurvan, det är enklast att regrediera genomsnittlig absorbans varje standard mot mikrogram D (+) glukos förekommer i varje standard, men man kan också Rita D (+) glukos koncentration (µg/µL) av varje standard om önskvärt. Följande beräkningar, se dock en standardkurva baserat på mikrogram, inte koncentrationer (µg/µL).
    6. Beräkna standardkurvan genom plottning genomsnittlig absorbans mot den totala mängden D (+) glukos (µg) i varje standardlösning. Passar en linjär regressionslinje till dessa data och sedan använda följande ekvation för att beräkna den totala mängden kolhydrater (µg) i varje okänt prov:
      Mc = (((enx -b)/m)/(15)) * 1000
      Mc = µg av kolhydrater i provet
      Ax = genomsnittlig absorbans okänt prov
      b = y-skärningspunkten (standard regressionslinjen)
      m = lutning (standard regressionslinjen)
      Korrelationskoefficienten för denna linje bör vara större än 0,98 och rutinmässigt nära 0,99. Använd sedan följande ekvation för att bestämma andelen kolhydrater i varje prov:
      Pc = ((Mc/1000) / (Mi)) * 100
      Pc = % kolhydrater
      Mjag = ursprungliga massa av provet (mg)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att Visa nyttan av dessa metoder, analyserade vi de lösligt protein och lättsmält kolhydratinnehållet i fyra olika fält och sockermajs vävnader som fungerar som distinkta potentiella näringsmässiga resurser för insekt växtätare. Vi samlat öron av majs från tre jordbruksregioner i USA (Minnesota, North Carolina och Texas), som omfattar fem olika sorter av sockermajs (dvs genotyper) och en mängd olika fält majs som en outgroup. Tabell 3 visar en sammanfattning av dessa majs prover och där de samlades in. Alla sorter samlades på förfallodagen, men på grund av utvecklingsmässiga skillnaderna mellan sorter, de var inte alla samlas in på den samma dagen efter plantering. Vi bearbetade öronen till olika vävnader genom att snabbt skilja den skal (modifierad blad omger cob) och silke (glänsande fibrer mellan skalet och kärnorna) från örat innan du förvarar alla vävnader vid-80 ° C som anges i metoderna. Varje vävnad var sedan frystorkat. När torkat, separerade vi kärnorna från basen och spetsen av örat av rakning av kärnor från den övre tredjedelen (spets) och undre tredjedelen (bas) på cob. Nästa, alla vävnader var mals till ett fint pulver. Vi analyserade sedan skalet, siden, spets kärna och bas kernel vävnadsprover för lösligt protein och lättsmält kolhydrat innehåll enligt de procedurer som beskrivs i metoderna ovan. Tanke på mängden vävnad finns analyserade vi sammanlagt 217 växtprover för både lösligt protein och lättsmält kolhydrat innehåll.

Lösligt Protein
Vi sprang nio prov plattor genom spektrofotometern totalt, och övergripande, standard kurvor hade hög korrelationskoefficienten (r), med värden mellan 0.985-1,00. Figur 1 visar den standardkurva erhålls med den högsta (A) och lägsta (B) r -värden att ställa ut det variabilitet som vi observerat över plattorna. Vi beräknas det % lösligt proteinet för alla prover med inledande provmassan (tabell 4) och sedan analyseras data för statistiska skillnader i lösligt proteininnehåll mellan regioner, sorter och vävnadstyper. Data var rank-omvandlad att möta normalitet antaganden när det behövs.

Vi observerade signifikanta skillnader i lösligt proteininnehåll mellan regioner (Welch ANOVA; F(2, 133,5) = 4.303, P = 0,015), som ett resultat, data från varje region analyserades därefter separat. Minnesota prover visade en signifikant interaktion mellan olika och vävnadstyp på lösligt proteininnehåll (tvåvägs ANOVA; F(3, 64) = 16,51, P < 0,001). De flesta vävnader hade liknande lösligt protein innehåll i bägge sorterna, förutom bas kärnor, där sockermajs sorten innehöll nästan 7 gånger det belopp jämfört med fältet majs sorten. För fältet majs sorten (Syngenta/NK-3122A-EZ), skal och sidentyger var liknande och hade det lägsta lösligt proteininnehållet av alla vävnader. Kärnor från toppen av örat hade högsta lösligt proteininnehållet och kärnor från basen av örat mellanliggande (figur 2a). För sockermajs sorten (Providence Bicolor) var alla vävnader och distinkta, med skal och sidentyger som innehåller lägst lösligt proteininnehåll och bas kärnor innehöll ~2.5 gånger mer än tip kärnor (figur 2b).

North Carolina prover visade också en signifikant interaktion mellan olika och vävnadstyp (tvåvägs ANOVA; F(3, 77) = 3.33, P < 0,024). De flesta vävnader visade liknande lösligt protein innehåll över sorter, förutom tip-kärnor som uppvisade en högre halt i icke -Bt mängd (Sweet G90 Hybrid). Bt var mängd (Seedway Bt 1576) skal vävnaden med det lägsta lösligt proteinhalt innehåll, följt av sidentyger och tip kärnor, som hade en liknande innehåll. Bas-kärnor hade högsta lösligt proteininnehållet men inte statistiskt skilt från det av tip kärnor (figur 2 c). I den icke -Bt sorten (Sweet G90 Hybrid) var alla vävnader distinkta utom spets och bas kärnor som var statistiskt liknande. Agnar hade det lägsta lösligt proteinhalt innehåll, följt av siden och spets och bas-kärnor som hade den högsta halten (figur 2d).

Texas prover visade signifikanta skillnader i lösligt proteininnehåll mellan sorter (tvåvägs ANOVA; F(1, 76) = 12,91, P = 0,001) och vävnader (tvåvägs ANOVA; F(3, 76) = 21.90, P < 0.001), men ingen signifikant interaktion (tvåvägs ANOVA; F(3, 76) = 0.436, P = 0,728). Sammantaget bicolor sorten (Sh2 SS2742 NAT III) visade en lägre genomsnittlig lösligt proteininnehåll än den Silver Queen sorten (TRTD F1 (su)). Över båda sorter, skal hade den lägsta proteinhalten, följt av silke, och sedan spets och bas kärnor, båda hade likaså hög halt (figur 2e-f).

Smältbara kolhydrater
Eftersom alla prover analyserades på en gång, körde vi bara en standardkurva. Figur 1 c visar att korrelationskoefficienten var hög, på 0.998. Vi beräknas % lättsmält kolhydratinnehållet för alla prover (tabell 5) och sedan analyseras data för statistiska skillnader i lättsmält kolhydrat innehåll mellan regioner, sorter och vävnadstyper. Data var rank-omvandlas när nödvändigt för att uppfylla normalitet antaganden.

Det fanns inga signifikanta skillnader mellan regioner (ANOVA; F(2, 216) = 1,47, P = 0.231), men för den skull kontinuitet med protein analyser vi igen analyserade data från varje region separat. Minnesota prover visade inga signifikanta skillnader i lättsmält kolhydrat innehåll mellan sorter (tvåvägs ANOVA; F(1, 64) = 0.00014, P = 0.990) eller vävnadstyp (tvåvägs ANOVA; F(3, 64) = 0.818, P = 0.489). Det fanns även ingen signifikant interaktion mellan olika och vävnad (tvåvägs ANOVA; F(3, 64) = 2.26, P = 0.092). Figur 2a -b visar att alla vävnader uppvisade en genomsnittliga halten av 36,5% (± 0,53).

North Carolina prover visade en signifikant effekt av vävnadstyp på lättsmält kolhydrat innehåll (tvåvägs ANOVA; F(3, 77) = 3,99, P = 0,011), men ingen effekt av sorten (tvåvägs ANOVA; F(1, 77) = 1.06, P = 0,307) eller interaktion (tvåvägs ANOVA; F(3, 77) = 0.465, P = 0.708). Figur 2 c -d visar att sidentyger hade det lägsta lättsmält kolhydratinnehållet, följt av skal, spets kärnor och bas kärnor. Alla vävnader var statistiskt liknande förutom silks och bas kärnor.

Texas prover visade ingen signifikant effekt av sorten (tvåvägs ANOVA; F(1, 76) = 0.834, P = 0.364) eller vävnadstyp (tvåvägs ANOVA; F(3, 76) = 1,03, P = 0.385), men visade en signifikant interaktion (tvåvägs ANOVA; F(3, 76) = 3.34, P = 0,024). Denna effekt var till stor del eftersom bas kernels i bicolor sorten (Sh2 SS2742 NAT III) hade en signifikant högre lättsmält kolhydrat innehåll än i Silver Queen sorten (TRTD F1 (su)). Figur 2e -f visar att det inte fanns några statistiska skillnader i lättsmält kolhydrat innehåll över vävnadstyper i Silver Queen sorten (TRTD F1 (su)), men det fanns en betydande skillnad mellan silke och bas kernel vävnader för bicolor mängd ( Sh2 SS2742 NAT III).

Figure 1
Figur 1. Standard kurvor för macronutrient analyser. (A) standardkurvan för lösligt protein analysen visar plattan med högsta korrelationskoefficienten (bästa kurva). (B) standardkurvan för lösligt protein analysen visar plattan med lägsta korrelationskoefficienten (värsta kurva). (C) standardkurvan för lättsmält kolhydrat analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Menar % lösligt protein och % lättsmält kolhydrat innehåll för varje vävnadstyp. (A) MN - Bt Syngenta/NK-3122A-EZ (fält majs), (B) MN - icke -Bt Providence Bicolor, (C) NC - Seedway Bt 1576, (D) NC - icke -Bt Sweet G90 Hybrid, (E) TX - Sh2 SS2742 F1 NAT III Bicolor, (F) TX - Silver Queen TRTD F1 (su). Cirklarna visar rådata, medan rutor visar medelvärden. Grön (skalet), röd (silk), gul (tip-kärnor) och lila (bas-kärnor). De prickade-linjerna ansluter ursprunget till varje ruta visar förhållandet P:C för varje vävnad (förhållandet är lutningen på den streckade linjen). Bokstäver utställningsresultat post hoc för protein skillnader längs övre och kolhydrat skillnaderna längs sidan, med olika bokstäver som representerar betydligt olika värden över vävnader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

IgG-koncentration (ug/uL) Protein i standardproven (ug)
0,0000 0
0.0125 2
0.0250 4
0,0375 6
0.0500 8
0.1000 16

Tabell 1. För lösligt protein analysens beräkningar på standardkurvan. Mängden protein i varje standard beräknas genom att koncentrationen av varje standard och att multipliceras med mängden standardlösning i varje brunn (160 µL).

D (+) glukos koncentration (ug/uL) D (+) glukos i standardproven (ug)
0,0000 0
0,0375 15
0.0750 30
0.1125 45
0.1500 60
0.1875 75

Tabell 2. Standardkurvan beräkning för lättsmält kolhydrat assay. Mängden glukos i varje standard beräknas genom att koncentrationen av varje standard och att multipliceras med mängden standardlösning i varje provrör (400 µL).

Region Mängd Läge N
Minnesota BT Syngenta/NK-3122A-EZ (fält majs) Rosemount, MN (44.7070,-93.1073) 10
icke - Bt Providence Bicolor Rosemount, MN (44.7070,-93.1073) 10
North Carolina icke - Bt Sweet G90 Hybrid Rocky Mount, NC (35.8918,-77.6780) 10
Seedway Bt 1576 Edenton, NC (36.1758,-76.7057) 10
Texas Sh2 SS2742 F1 NAT III Bicolor Lubbock, TX (33.6935,-101.8249) 10
Silver Queen TRTD F1 (su) Lubbock, TX (33.6935,-101.8249) 10

Tabell 3. Sammanfattning av majs provtagning läge och sorter. För varje region och olika kombination, samlades 10 öron och fyra vävnader analyserades: skalet, sidentyger, tip-kärnor och bas kärnor.

Region Mängd % lösligt protein
skalet Silks Tip-kärnan bas-kärnan
Minnesota BT Syngenta/NK-3122A-EZ (fält majs) 3.29 ± 0,38 4.57 ± 1,27 14.74 ± 1,54 7,07 ± 0,84
icke - Bt Providence Bicolor 3.35 ± 0,58 6,71 ± 0,70 17.87 ± 3,85 48.41 ± 2,85
North Carolina icke - Bt Sweet G90 Hybrid 2.90 ± 0,60 6.97 ± 0,63 12,95 ± 0.86 12.23 ± 0,83
Seedway Bt 1576 5.48 ± 0,73 9,08 ± 0,62 10.75 ± 0,93 12,76 ± 1.16
Texas Sh2 SS2742 F1 NAT III Bicolor 7.74 ± 1,03 12,15 ± 0,63 14.79 ± 0,69 14.88 ± 0,48
Silver Queen TRTD F1 (su) 6.06 ± 1,05 8,17 ± 0,79 12,95 ± 1,19 12,32 ± 1,23

Tabell 4. Protein medelvärden för varje region, variation och vävnad typ. Menar procentsatser (av torrvikt) visas ± 1 SE.

Region Mängd % smältbara kolhydrater
skalet Silks Tip-kärnan bas-kärnan
Minnesota BT Syngenta/NK-3122A-EZ (fält majs) 37.55 ± 0,88 32.31 ± 1,38 36.79 ± 1,60 38.66 ± 1,57
icke - Bt Providence Bicolor 37.30 ± 0,82 37,31 ± 2,30 35.80 ± 1,77 34.83 ± 1,37
North Carolina icke - Bt Sweet G90 Hybrid 35.79 ± 0,81 35.28 ± 1.17 36,13 ± 0,91 39.47 ± 1,18
Seedway Bt 1576 35,75 ± 0,58 34.91 ± 0,76 35.73 ± 1,35 37.29 ± 1.13
Texas Sh2 SS2742 F1 NAT III Bicolor 35.55 ± 0,87 33.40 ± 1.10 34.85 ± 1,01 39.14 ± 1,22
Silver Queen TRTD F1 (su) 34.63 ± 1.13 33.42 ± 2,33 35.16 ± 1.16 33.93 ± 1,03

Tabell 5. Kolhydrat medelvärden för varje region, variation och vävnad typ. Menar procentsatser (av torrvikt) visas ± 1 SE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Genom att kombinera väletablerade kolorimetriska analyser med effektiv anläggningsspecifika extraktion protokoll, erbjuda analyserna visade här en rimlig och noggrann metod för att mäta växt lösligt protein och lättsmält kolhydrat innehåll. Våra resultat med majs som ett föredöme illustrerar hur dessa protokoll kan användas för att erhålla exakta mätningar över olika biologiskt relevanta rumsliga skalor. Till exempel kunde vi identifiera skillnader i växten lösligt protein och lättsmält kolhydrat innehåll mellan geografiska regioner, sorter (eller genotyper), vävnadstyper, och även rumsligt segregerade vävnader. Båda analyser kan göras med hjälp av gemensamma laboratorieutrustning och reagenser, kräver endast grundläggande laboratorium kompetens, och kan analysera ett relativt stort antal prover (50-75) inom en kort tidsram.

Även om det är relativt lätt att utföra, några steg är mer kritiska än andra, och om det görs felaktigt kan begränsa noggrannheten i resultaten. Exempelvis är det absolut nödvändigt att växtmaterial hanteras korrekt under provtagning. Även dissekerade växtvävnad förblir metaboliskt aktiva tills utsätts för en dödlig temperatur, och under denna period växt macronutrient innehåll kan ändras. Som ett resultat, kan långa tidsperioder mellan växt provtagning och frysning (antingen av flytande N eller frys lagring) öka sannolikheten att prov växt macronutrient innehåll inte kanske återspeglar innehållet som var närvarande vid tidpunkten för provtagning.

Steg 2.3.3-2.3.5 i protokollet protein är särskilt viktiga för ett lyckat resultat, eftersom dessa steg behandlar med utfällda proteiner. Var noga med att undvika att förlora någon av protein pelleten när dammsugning den supernatant TCA från mikrocentrifugrör, eftersom detta kommer att leda till en underskattning av proteinhalten. Det är också viktigt när du tvättar protein pelleten med aceton till att göra det mycket snabbt. Aceton kan försämra pelleten om kvar i kontakt i flera sekunder. Vi föreslår att begränsa kontakt mellan aceton och pelleten till mindre än 5 sekunder. Slutligen, när torkning pelleten, det är viktigt att vara noga med att endast tillåta tillräckligt med tid för aceton avdunsta. Om pelleten är kvar för att torka för länge, blir det mycket svårt att Återsuspendera i NaOH. Vi föreslår torkning pelleten i 30 minuter och sedan kontroll av förekomst av aceton, antingen genom att visuellt Observera vätska i röret eller genom att noggrant upptäcka lukten av aceton rök. Fortsätta kontrollera pelleten varje 10-15 minuter tills aceton har avdunstat.

Såsom anges i Bradford 197616, möjliggör kvantifiering stegen med Coomassie brilliant blue G-250 dye hög känslighet, med en standardavvikelse på endast 5 µg protein/mL, hög protein-dye komplexa stabilitet och begränsad inblandning av icke-protein föreningar. Denna analys har ett detektionsområde mellan 1-20 µg totalt proteiner per mikroplattan väl (låg-koncentration assay) eller högst 25 µg/mL; koncentrationer som överstiger högsta standard bör dock utspädd och åter analyseras för de mest exakta resultaten (protokollet producerar ett överskott av lösning om sådana spädningar och re-analys är nödvändig). Det finns en bias för färgämnet prioriterat binda till grundläggande aminosyror, arginin och aromatisk aminosyra restsubstanser, Bradford analysen är dock den mest korrekta och lätt att använda metoden för totalt protein kvantifiering i blandade prover.

Lättsmält kolhydrat analysen är en snabb, kostnadseffektiv och enkel metod för att kvantifiera växt sackarider medan exklusive strukturella kolhydrater (t.ex. cellulosa), som är svårsmält av de flesta växtätare. Mest problematiska stegen i kolhydrat analyserna är steg 3.2.1 och 3.3.2-3.3.4. Här är det avgörande att hålla rören upprätt och dra åt skruvlock väl när kokning, som införandet av något vatten kommer Späd prover och påverka exakt kvantifiering. Även vård måste vidtas när du arbetar med fenol och koncentrerad svavelsyra, som både är starkt frätande. Det bör noteras att vi förespråkar inspelning prov absorbansen vid 490 nm, vilket är maximal absorbans för Hexoser, men inte andra sockerarter, såsom pentoses och uronic syror som har en maximal absorbans vid 480 nm20,21. För socker blandningar i växtprover, 490 nm ger en lämplig våglängd för att kvantifiera totala kolhydrat innehåll22,23,24, men för en mer detaljerad analys av olika sockerarter se20, 21. Det bör också noteras att Masuko o.a. 23 ger en strömlinjeformad mikroplattmetoden används för fenol-sulfuric syra kolhydrat analys.

En annan anmärkningsvärd metod för att uppskatta växt näringsrikt innehåll25,26,27 är nära-infraröd spektroskopi (NIRS). NIRS-teknik används ofta i jordbruket och livsmedelsproduktionen. Denna alternativa teknik är icke-invasiv, icke-förstörande, tar en bråkdel av tid som är inblandade i någon våt kemi metod och kan tillämpas på olika skalor från ett landskap ner till en enskild bit växtvävnad. Denna teknik mäter näringsämnen indirekt och bygger på korrekta våta kemi mätningar av växten kemikalien av intresse för kalibrering. De metoder som beskrivs häri måste därför en kritisk plats i framtiden för anläggningen näringsämnesanalyser, se till att kalibreringen är baserat på lösliga och lättsmält macronutrient kvantifiering och inte påverkade av icke-nutritive elementärt surrogat.

Metoderna som presenteras för att mäta växt lösligt protein och lättsmält kolhydratinnehållet har betydande konsekvenser för de miljömässiga och biologiska vetenskaperna. Trots en mängd information om elementär sammansättningen av planta vävnader saknas information om anläggningen macronutrient innehåll allvarligt. Med tanke på de begränsningar som finns i korrelera elementära åtgärder med macronutrient är innehåll och erkänner det starka förhållandet mellan växt närings innehåll och högre ordning ekologiska processer, att erhålla denna typ av data avgörande för framåt områdena växtfysiologi, näringsmässiga ekologi, växt-herbivor interaktioner, mat-web dynamics11,28,29,30. Det är vår förhoppning att ger en tydlig och lättillgänglig metod för att mäta växt lösligt protein och lättsmält kolhydrat innehåll kommer att uppmuntra forskare att samla in och införliva denna typ av data i framtida forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Tack vare alla våra samarbetspartners som har bistått med sockermajs fältet samlingar, inklusive Dominic Reisig och Dan Mott vid North Carolina State University, och Pat Porter vid Texas A & M University i Lubbock, TX. Tack till Fiona Clissold för att hjälpa till att optimera protokoll och ge redigeringar till detta manuskript. Detta arbete stöds delvis av Texas A & M C. Everette Rebeccas Fellowship (Institutionen för entomologi) och bioteknik Risk bedömning Grant programmet konkurrenskraftiga bevilja nr 2015-33522-24099 från US Department of Agriculture (tilldelas GAS och STB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
microplate reader (spectrophotometer) Bio-Rad Model 680 XR
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate Bio-Rad #5000006 450mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simpson, S. J., Raubenheimer, D. The Nature of Nutrition: A Unifying Framework from Animal Adapation to Human Obesity. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (2012).
  2. Behmer, S. T. Insect herbivore nutrient regulation. Annual Review of Entomology. 54, 165-187 (2009).
  3. Epstein, E. Mineral nutrition of plants: mechanisms of uptake and transport. Annual Review of Plant Physiology. 7 (1), 1-24 (1956).
  4. Chapin, F. S. III The mineral nutrition of wild plants. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 11 (1), 233-260 (1980).
  5. Marschner, H. Marschner's Mineral Nutrition of Higher Plants. , Academic press. London, UK. (1956).
  6. Stieger, P. A., Feller, U. Senescence and protein remobilization in leaves of maturing wheat plants grown on waterlogged soil. Plant and Soil. 166, 173-179 (1994).
  7. Li, R., Volenec, J. J., Joern, B. C., Cunningham, S. M. Seasonal changes in nonstructural carbohydrates, protein, and macronutrients in roots of alfalfa, red clover, sweetclover, and birdsfoot trefoil. Crop Science. 36, 617-623 (1996).
  8. Sánchez, E., Rivero, R. M., Ruiz, J. M., Romero, L. Changes in biomass, enzymatic activity and protein concentration in roots and leaves of green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike) under high NH4NO3 application rates. Scientia Horticulturae. 99, 237-248 (2004).
  9. Lenhart, P. A., Eubanks, M. D., Behmer, S. T. Water stress in grasslands: Dynamic responses of plants and insect herbivores. Oikos. 124, 381-390 (2015).
  10. Machado, A. R., Arce, C. C. M., Ferrieri, A. P., Baldwin, I. T., Erb, M. Jasmonate-dependent depletion of soluble sugars compromises plant resistance to Manduca sexta. New Phytologist. 207, 91-105 (2015).
  11. Deans, C. A., Behmer, S. T., Fiene, J., Sword, G. A. Spatio-temporal, genotypic, and environmental effects of plant soluble protein and digestible carbohydrate content: implications for insect herbivores with cotton as an exemplar. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1151-1163 (2016).
  12. Boisen, S., Bech-Andersen, S., Eggum, B. O. A critical view of the conversion factor 6.25 from total nitrogen to protein. Acta Agriculturae Scandinavica. 37, 299-304 (1987).
  13. Seed protein contents and nitrogen-to-protein conversion factors for some uncultivated tropical plant seeds. Food Chemistry. Ezeagu, I. E., Petzke, J. K., Metges, C. C., Akinsoyinu, A. O., Ologhobo, A. D. 78, 105-109 (2002).
  14. Izhaki, I. Influence of nonprotein nitrogen on estimation of protein from total nitrogen in fleshy fruits. Journal of Chemical Ecology. 19, 2605-2615 (1993).
  15. Mossé, J. Nitrogen to protein conversion factor for ten cereals and six legume or oilseeds. A reappraisal of its definition and determination. Variation according to species and seed protein content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 18-24 (1990).
  16. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  17. Jones, C. G., Hare, J. D., Compton, S. J. Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology. 15 (3), 979-992 (1989).
  18. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colormetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Biochemistry. 28, 350-358 (1956).
  19. Clissold, F. J., Sanson, G. D., Read, J. The paradoxical effects of nutrient ratios and supply rates on an outbreaking insect herbivore, the Australian plague locust. Journal of Animal Ecology. 75, 1000-1013 (2006).
  20. Smith, D., Paulsen, G. M., Raguse, C. A. Extraction of total available carbohydrates from grass and legume tissue. Plant Physiology. 39 (6), 960-962 (1964).
  21. Cui, S. W. Food carbohydrates: Chemistry, physical properties, and applications. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (2005).
  22. Chow, P. S., Landhäusser, S. M. A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree Physiology. 24 (10), 1129-1136 (2004).
  23. Masuko, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S. I., Lee, Y. C. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Analytical Biochemistry. 339 (1), 69-72 (2005).
  24. Foley, W. J., McIlwee, A., Lawler, I., Aragones, L., Woolnough, A. P., Berding, N. Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy- a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia. 116 (3), 292-305 (1998).
  25. Kokaly, R. F. Investigating a physical basis for spectroscopic estimates of leaf nitrogen concentration. Remote Sensing of Environment. 75 (2), 153-161 (2001).
  26. Schulz, H., Baranska, M. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy. Vibrational Spectroscopy. 43 (1), 13-25 (2007).
  27. Cozzolino, D., Morón, A. The potential of near-infrared reflectance spectroscopy to analyse soil chemical and physical characteristics. The Journal of Agricultural Science. 140, 65-71 (2003).
  28. Simpson, S. J., Sword, G. A., Lorch, P. D., Couzin, I. D. Cannibal crickets on a forced march for protein and salt. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4152-4156 (2006).
  29. Lihoreau, M., Buhl, J., Sword, G. A., Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Nutritional ecology beyond the individual: a conceptual framework for integrating nutrition and social interactions. Ecology Letters. 18 (3), 273-286 (2015).
  30. Deans, C. A., Behmer, S. T., Tessnow, A., Tamez-Guerra, P., Pusztai-Carey, M., Sword, G. A. Nutrition affects insect susceptibility to Bt. Scientific Reports. 7, 39705 (2017).

Tags

Environmental Sciences fråga 138 makronäringsämnen nutrition växtförsvar jordbruk geometriska ram insekt fysiologi
Kvantifiera växt lösligt Protein och lättsmält kolhydrat innehåll, med hjälp av majs (<em>Zea mays</em>) som ett föredöme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deans, C. A., Sword, G. A., Lenhart, … More

Deans, C. A., Sword, G. A., Lenhart, P. A., Burkness, E., Hutchison, W. D., Behmer, S. T. Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar. J. Vis. Exp. (138), e58164, doi:10.3791/58164 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter