Kvantitativ PCR av T7 Bacteriophage fra Biopanning
Summary
En reproduserbare, nøyaktig og tid effektiv kvantitative PCR (qPCR) metode for å liste opp T7 bacteriophage er beskrevet her. Protokollen tydelig beskriver phage genomisk DNA forberedelse, PCR reaksjon forberedelse, qPCR sykling forhold og qPCR dataanalyse.
Abstract
Denne protokollen beskriver bruken av kvantitative PCR (qPCR) til å nummerere T7 phages fra phage utvalg eksperimenter (dvs. “biopanning”). qPCR er en fluorescens tilnærming å kvantifisere DNA, og her er det tilpasset å kvantifisere phage genomer som en proxy for phage partikler. I denne protokollen beskrives lettvinte phage DNA forberedelse metode med høy temperatur varme uten ekstra DNA rensing. Metoden må bare små mengder varmebehandlet phages og små mengder qPCR reaksjonen. qPCR er høy gjennomstrømming og rask, behandle og hente data fra en 96-brønns plate reaksjoner i 2-4 h. forhold til andre phage opplisting tilnærminger, qPCR er mindre tidkrevende. Her qPCR til å Nummerer T7 phages identifisert fra biopanning mot i vitro cystisk fibrose-lignende Slim modell. Metoden qPCR kan utvides for å kvantifisere T7 phages fra andre eksperimenter, inkludert andre typer biopanning (f.eks., immobilisert protein bindende, i vivo phage screening) og andre kilder (f.eks vannsystemer eller kroppsvæsker). I sammendraget, kan denne protokollen endres for å kvantifisere DNA-innkapslet virus.
Introduction
Bacteriophage (phage) teknologien, utviklet av George Smith i 1985, er en kraftig, høy gjennomstrømming tilnærming til å identifisere peptid eller protein ligander mot mål eller reseptorer cellemembranen, sykdom antigener, mobilnettet organeller eller spesifikke organer og vev i de siste to tiår1,2. Her, tilfeldig biblioteker av polypeptides eller enkelt kjede antistoffer vises på frakken proteiner av phages (vanligvis M13 eller T7), og bestemte ligander kan identifiseres fra panorering mot immobilisert proteiner i vitro eller i vivo biologiske systemer gjennom en iterativ utvelgelsesprosessen. Deretter kan ligander kombineres med bildebehandling eller terapeutiske agenter for diagnostisering og behandling av sykdommer3,4. Det er viktig å nøyaktig liste phages i flere trinnene i biopanning: (1) å kvantifisere phages som binder til underlaget og (2) å kvantifisere phages om det er berikelse med hver runde utvalg (phage berikelse angir biopanned phage affinitet for målet). Gjeldende gullstandarden for kvantifisering, tolags plakk analysen, presenterer flere utfordringer; Det er kjedelig, tungvint og potensielt unøyaktige for mange eksempler. Derfor har vår gruppe utviklet en følsom, reproduserbare, nøyaktig og tidseffektive kvantitative polymerase kjedereaksjon (qPCR) metode for å nummerere M13 og T7 phage partikler fra biopanning5.
qPCR er en attraktive og gjennomførbare metoden å tallfeste nøyaktig T7 og M13 phages. Siden hver individuelle phage partikkel kan bare inneholde én kopi av genomisk DNA (dsDNA eller ssDNA), tilsvarer en phage genomet en phage partikkel; kvantifisere antall phage genomer, er det mulig å kvantifisere antall phages. Under qPCR, fluorescerende reporter fargestoffer binde phage genomisk DNA nonspecifically eller spesielt gjennom sekvens-spesifikke primere under PCR forsterkning og fluorescensen signal øker med hver runde forsterkning. Når fluorescens signalet når grenseverdien, som runde/syklus av forsterkning er kjent som den terskel syklusen (Ct). Kjente konsentrasjonen av referanse phage DNA plottes mot Ct verdiene for å etablere en standard kurve. Bruk av standardkurve med Ct verdiene av DNA-prøver, kan konsentrasjonen av phages være interpolert.
Mens mange strategier har vært utviklet og mye brukt om å kvantifisere phages fra biopanning, har hver av dem spesifikke utfordringer. Den mest populære og konvensjonelle metoden er tolags plakk analysen. Her, vert bakterier er infisert med phages forberedt på seriell fortynninger, er belagt på et solid agar substrat og er kledde med agar; phages er nummerert med antall plaketter dannet (dvs. plakk danner enheter eller pfu) på agar tallerkenen. Plakk analysen er følsom men kjedelig, tidkrevende og unøyaktig, spesielt for mange eksempler og med høye konsentrasjoner5. I tillegg er enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA) tilpasset nummerere M13 og T7 phage partikler6,7,8. Her phages på ulike fortynninger er bundet og tatt på et solid substrat (dvs. en microplate), analysert med phage-spesifikke antistoffer og oppdaget med journalister (f.eks enzym følsom kromogent underlag, fluorophores) å bestemme antall phage partikler tilstede. Readouts (f.eks fluorescens, absorbans) av prøver kan brukes å kvantifisere ukjent konsentrasjoner mot phage standarder i kjente konsentrasjoner. Forskjellige phage-baserte ELISAs har blitt utviklet, men de har potensielle begrensninger. En gruppe utviklet en papirbasert sandwich ELISA med et kvantifisering område som spredte syv størrelsesordener (102-109 pfu/mL); men denne metoden krevde flere trinn av antistoff belegg og tok opp til en hel dag for analysen8. Vår gruppe også utviklet en ELISA metode for å kvantifisere M13 phage partikler, men hadde en mindre sensitive rekkevidde på 106 1011 pfu/mL5. Valgbar transisjonsmetall fluorescens sonder er utviklet for å nummerere M13 og kvantifisering data kan hentes innen 20 min; Denne analysen har imidlertid et lite dynamisk område med 109 til 1012 pfu/mL9. En gruppe brukt atomic force mikroskopi nummerere M13 phage partikler i løsningen, men dette krever avansert elektronmikroskop og bare jobbet innenfor et lite område med konsentrasjoner10. En annen studie brukes monodisperse emulsjoner å felle fluorescerende M13 og T4 reporter phages og telle phages på antall fluorescerende dråper; men denne tilnærmingen også utstilt en smal kvantifisering varierer fra 102 til 106 pfu/mL11. Mens slippverktøy digital PCR har blitt brukt om å kvantifisere M13 phages, er denne tilnærmingen stand til å skille mellom den smittsomme og ikke-smittsomme phage partikler12.
Vår gruppe har nylig utviklet qPCR metoder for å liste opp T7 og M13 phages identifisert fra biopanning mot en blod – hjerne barrieren celle modell bruker to ulike fluorescerende reporter fargestoffer5. Sammenlignet med nevnte kvantifisering metoder, qPCR metodene vi utviklet var høy gjennomstrømming og tidkrevende å kvantifisere mange eksempler og kunne skille mellom infeksjonssykdommer og ikke-smittsomme phages med DNase jeg pre-behandling av den phage prøver. Viktigere, kan denne tilnærmingen reproduserbar og nøyaktig kvantifisere M13 og T7 bacteriophages fra biopanning prøver. For å veilede nybegynnere forskere innen phage qPCR, beskriver her vi en detaljert qPCR metode for å liste opp T7 phage partikler fra et cystein begrenset bibliotek (CX7C) panorert mot en i vitro cystisk fibrose (CF) slim-barriere. Fra dette arbeidet, kan qPCR metoden utvides for å kvantifisere phage partikler fra andre typer biopanning og fra andre kilder, inkludert vann, jord og kroppsvæsker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utviklet qPCR metoder for å kvantifisere phage genomisk DNA5, og her vi beskrev og tilpasset en qPCR metode for å liste opp T7 phages valgt mot en CF-lignende Slim barriere. Minimum informasjon om retningslinjer for publisering av kvantitative Real-Time PCR eksperimenter (MIQE) ble tilpasset for å utvikle og validere metoden qPCR for opplisting T7 phages15. Protokollen vi utviklet for å kvantifisere phages fra biopanning eksperimenter er en tidkrevende, pålitelig og…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av PhRMA Foundation Starter forskningsstipend og nasjonale hjerte, lunge og blod Institutt for National Institutes of Health gi prisen nummer R01HL138251.
Materials
| Materials and reagents | |||
| Primers for T7 genomic DNA | IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT |
|
| T7Select packaging control DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR master mix–Power up SYBR Green master mix | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp optical adhesive film kit | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 Cloning Kit | EMD Millipore | 70015 | User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I solution | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24-well transwell plate | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21040CV | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater | ThermoFisher Scientific | Model:2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| QuantStudio Real-time PCR software | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| Real-time qPCR primer design | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
Riferimenti
- Smith, G. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).
- Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).
- Dias-Neto, E., et al. Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis. PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).
- Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR. Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).
- Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).
- Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage. Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).
- Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR. J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).
- Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminmäki, U. Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes. BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).
- Schlaman, H. R. M., et al. Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy. Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).
- Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions. Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).
- Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR. Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).
- . T7Select® Biopanning Kit Available from: https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit (2018)
- Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. Linear Regression Analysis. Deutsches Ärzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).
- Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Fittipaldi, M., et al. Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR. Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).
- Lodder, W. J., et al. Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR. Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).
- Brown-Jaque, M., et al. Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates. International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).
- Naveca, F. G., et al. Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).
- Jia, J., et al. Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR. Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).
- Bliem, R., et al. A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments. Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).
- Wan, Z., Goddard, N. L. Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study. G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).
