Kvantitativ PCR av T7 Bacteriophage från Biopanning
Summary
En reproducerbar, korrekt och tid effektiv kvantitativ PCR (qPCR) metod att räkna upp T7 bacteriophage beskrivs här. Protokollet beskrivs tydligt phage genomisk DNA förberedelse, PCR-reaktion förberedelse, qPCR cykling villkor och qPCR dataanalys.
Abstract
Det här protokollet beskriver användningen av kvantitativ PCR (qPCR) att räkna upp T7 fagocyt från phage urval experiment (dvs, ”biopanning”). qPCR är en fluorescens-baserad metod för att kvantifiera DNA, och här är det anpassat till kvantifiera phage genomen som en proxy för phage partiklar. I detta protokoll beskrivs en lättköpt phage DNA förberedelse metod med hög temperatur värme utan ytterligare DNA-rening. Metoden behöver bara små volymer av värmebehandlad fagocyt och små volymer av qPCR reaktionen. qPCR är hög genomströmning och snabb, bearbeta och få data från en plattan med 96 brunnar av reaktioner i 2 – 4 h. jämfört med andra phage uppräkning synsätt, qPCR är mer tidseffektivt. Här används qPCR att räkna upp T7 fagocyt identifierade från biopanning mot i vitro cystisk fibros-liknande slem modell. Metoden qPCR kan utvidgas till att kvantifiera T7 fagocyt från andra experiment, inklusive andra typer av biopanning (t.ex., orörlig proteinbindning, invivo phage screening) och andra källor (t.ex. vattensystem eller kroppsvätskor). Sammanfattningsvis kan detta protokoll ändras för att kvantifiera eventuella DNA-inkapslade virus.
Introduction
Bacteriophage (fag) displayteknik, utvecklad av George Smith 1985, är en kraftfull, hög genomströmning metod att identifiera peptid eller protein ligander mot mål eller receptorer från cellmembranet, antigener, cellulära organeller eller specifika organ och vävnader i senaste två decennierna1,2. Här random bibliotek av polypeptider eller enda kedja antikroppar visas på pälsen proteiner av Fager (vanligtvis M13 eller T7) och specifika ligander kan identifieras från panorering mot immobiliserade proteiner in vitro- eller in vivo biologiska system genom en iterativ urvalsprocess. Ligander kan sedan kopplas till imaging eller terapeutiska agens för diagnos och behandling av sjukdomar3,4. Det är viktigt att noggrant räkna upp Fager under flera steg av biopanning: (1) för att kvantifiera Fager som binder till underlaget och (2) för att kvantifiera fagocyt för att avgöra om det finns berikning med varje omgång av urval (phage anrikning indikerar biopanned phage affinitet för målet). Nuvarande guldmyntfoten för kvantifiering, dubbla lager plack assay, presenterar flera utmaningar; Det är tråkiga, besvärliga och potentiellt felaktiga för ett stort antal prover. Vår grupp har därför utvecklat en känslig, reproducerbara, korrekt och tidseffektiv kvantitativa polymerase chain reaktion (qPCR) metod för att räkna upp M13 och T7 phage partiklar från biopanning5.
qPCR är en attraktiv och genomförbar metod att exakt kvantifiera T7 och M13 Fager. Eftersom varje enskild phage partikel kan endast innehålla en kopia av genomisk DNA (dsDNA eller ssDNA), är en phage genomet motsvarande en phage partikel; kvantifiera antalet phage genomen, är det möjligt att kvantifiera antalet Fager. Under qPCR, fluorescerande reporter färgämnen binder phage genomiskt DNA icke-specifikt eller särskilt genom sekvens-specifika primers under PCR-amplifiering, och fluorescensen signal ökar med varje runda av förstärkning. När fluorescens signalen når tröskeln, som runda/cykel av förstärkning noteras som tröskel cykeln (Ct). De kända koncentrationerna av referens phage DNA ritas mot sin Ct-värden att upprätta en standardkurva. Med standardkurvan med Ct värdena av DNA-prover, kan koncentrationerna av fagocyt interpoleras.
Medan många strategier har tidigare utvecklats och i stor utsträckning använts för att kvantifiera fagocyt från biopanning, har alla av dem särskilda utmaningar. Den mest populära och konventionella metoden är dubbla lager plack assay. Här, värd bakterier är infekterade med fagocyt beredd på seriespädningar, är pläterade på en solid agar substrat och överdras med agar; Fager är uppräknade med antalet plack bildas (dvs plack bildar enheter eller pfu) på en agarplatta. Plack-analysen är känslig men tråkiga, tidskrävande och felaktig, särskilt för många prover och med höga koncentrationer5. Dessutom har enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) anpassats till räkna upp M13 och T7 phage partiklar6,7,8. Här, Fager på olika spädningar är bundna och fångas på ett fast underlagsmaterial (dvs. en mikroplattan), utforskad med phage-specifika antikroppar och påvisas med hjälp av reportrar (t.ex. enzymet känsliga kromogent substrat, fluorophores) till bestämma antalet phage partiklar. Avläsning (t.ex. fluorescens, absorbans) prover kan användas för att kvantifiera okända koncentrationer mot phage standarder på kända koncentrationer. Olika phage-baserade Elisatest har utvecklats men de har potentiella begränsningar. En grupp utvecklat en pappersbaserade sandwich-ELISA med en kvantifiering utbud som sträcker sig över sju tiopotenser (102-109 pfu/mL); men denna metod krävs flera steg av antikropp beläggning och tog upp till en hel dag för assay8. Vår grupp också utvecklat en ELISA-metod för att kvantifiera M13 phage partiklar men hade en mindre känsliga detekteringsområde 106 till 1011 pfu/mL5. Omkopplingsbar lanthanide fluorescens sonder har utvecklats för att räkna upp M13 och kvantifiering uppgifter kunde erhållas inom 20 min; denna analys har dock ett smalt dynamiska omfång med 109 1012 pfu/mL9. En grupp används atomic force microscopy att räkna upp M13 phage partiklar i lösning, men detta kräver avancerad elektronmikroskopi och bara arbetat inom ett snävt intervall av koncentrationer10. En annan studie används monodisperse emulsioner att fälla fluorescerande M13 och T4 reporter fagocyt och räkna fagocyt av antalet fluorescerande droppar; dock detta tillvägagångssätt också uppvisade ett smalt kvantifiering utbud från 102 106 pfu/mL11. Samtidigt droplet digital PCR har använts för att kvantifiera M13 fagocyt, är detta tillvägagångssätt inte kan skilja mellan antalet smittsamma och icke-infektiös phage partiklar12.
Vår grupp har nyligen utvecklat qPCR metoder för att räkna upp T7 och M13 fagocyt identifierade från biopanning mot en blod – hjärnbarriären cell modell med två olika fluorescerande reporter färgämnen5. Jämfört med tidigare nämnda kvantifiering metoder, qPCR metoder vi utvecklat var hög genomströmning och tidseffektivt att kvantifiera många prover och kunna skilja mellan smittsamma och icke-infektiös fagocyt med DNAS jag förbehandling av den phage prover. Detta tillvägagångssätt kan allt reproducibly och exakt kvantifiera M13 och T7 bakteriofager från biopanning prover. För att vägleda nybörjare forskare i området i phage qPCR, beskriver här vi en detaljerad qPCR metod för att räkna upp T7 phage partiklar från ett cystein-constrained bibliotek (CX7C) panoreras mot en slem i vitro cystisk fibros (CF) barriär. Från detta arbete, kan qPCR metod utvidgas till att kvantifiera phage partiklar från andra typer av biopanning och från andra källor, inklusive vatten, jord och kroppsvätskor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utvecklat qPCR metoder för att kvantifiera phage genomisk DNA5och här vi beskrivit och anpassas en qPCR metod för att räkna upp T7 fagocyt markerat mot CF-liknande slem barriär. Minsta Information för offentliggörande av kvantitativa Real-Time PCR-experiment (MIQE) riktlinjer anpassades för att utveckla och validera metoden qPCR för uppräkning av T7 fagocyt15. Det protokoll som vi utvecklat för att kvantifiera fagocyt från biopanning experiment är en tidseff…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av PhRMA Foundation forskningsbidrag Starter och den nationella hjärta, lungor och blod Institute of National Institutes of Health bevilja under award nummer R01HL138251.
Materials
| Materials and reagents | |||
| Primers for T7 genomic DNA | IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT |
|
| T7Select packaging control DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR master mix–Power up SYBR Green master mix | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp optical adhesive film kit | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 Cloning Kit | EMD Millipore | 70015 | User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I solution | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24-well transwell plate | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21040CV | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater | ThermoFisher Scientific | Model:2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| QuantStudio Real-time PCR software | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| Real-time qPCR primer design | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
Riferimenti
- Smith, G. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).
- Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).
- Dias-Neto, E., et al. Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis. PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).
- Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR. Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).
- Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).
- Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage. Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).
- Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR. J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).
- Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminmäki, U. Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes. BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).
- Schlaman, H. R. M., et al. Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy. Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).
- Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions. Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).
- Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR. Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).
- . T7Select® Biopanning Kit Available from: https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit (2018)
- Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. Linear Regression Analysis. Deutsches Ärzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).
- Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Fittipaldi, M., et al. Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR. Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).
- Lodder, W. J., et al. Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR. Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).
- Brown-Jaque, M., et al. Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates. International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).
- Naveca, F. G., et al. Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).
- Jia, J., et al. Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR. Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).
- Bliem, R., et al. A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments. Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).
- Wan, Z., Goddard, N. L. Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study. G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).
