इस प्रोटोकॉल सिलिकॉन के लिए एक heterobifunctional silane युग्मन एजेंट के साथ प्रोटीन के आबंध स्थिरीकरण का वर्णन-ऑक्साइड सतहों परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी आधारित एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए डिज़ाइन किया गया है जो द्वारा उदाहरण है fibronectin के साथ RrgA ( एस. निमोनिया के pilus-1 टिप adhesin) की बातचीत ।
हाल के वर्षों में, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) आधारित एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (SMFS) आणविक संपत्तियों और कार्यों की हमारी समझ को बढ़ाया. यह हमें करने के लिए एक भौतिक तंत्र की बहुलता का पता लगाने का अवसर दिया, जैसे, कैसे बैक्टीरियल adhesins और अधिक विस्तार में सतह रिसेप्टर्स की मेजबानी के लिए बाध्य । अंय कारकों के अलावा, SMFS प्रयोगों की सफलता ठोस सतहों और AFM सुझावों पर ब्याज की कार्यात्मक और देशी के स्थिरीकरण पर निर्भर करता है । यहां, हम सिलिकॉन के लिए प्रोटीन का आबंध युग्मन के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल का वर्णन silane-खूंटी-carboxyls और अच्छी तरह से स्थापित N-hydroxysuccinimid/1-एथिल-3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimid (EDC/ स्ट्रेप्टोकोकस मैट्रिक्स प्रोटीन extracellular (एफ एन) के साथ ग्राम पॉजिटिव जीवाणु fibronectin निमोनिया (एस निमोनिया) से pilus-1 adhesin RrgA की बातचीत का पता लगाने के लिए । हमारे परिणाम बताते है कि सतह functionalization कांच की सतह पर एफ एन के एक समरूप वितरण की ओर जाता है और AFM ब्रैकट टिप पर RrgA की एक उचित एकाग्रता के लिए, SMFS के दौरान बातचीत की घटनाओं के 20% तक के लक्ष्य मूल्य से स्पष्ट माप और पता चला कि RrgA बांध ५२ pN का मतलब बल के साथ एफ एन के लिए । प्रोटोकॉल साइट विशिष्ट मुक्त thiol समूहों के माध्यम से जोड़े को समायोजित किया जा सकता है । एक पूर्वनिर्धारित प्रोटीन या अणु अभिविंयास में यह परिणाम है और SMFS के अलावा अंय भौतिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है ।
ऑप्टिकल और चुंबकीय चिमटी के बगल में, परमाणु बल माइक्रोस्कोप (AFM)1,2 एक उपयोगी उपकरण के रूप में उभरा है विश्लेषण और अणुओं में हेरफेर और उनके गुण और कार्य, बाहरी बल 3 के लिए अपनी प्रतिक्रिया सहित उनकी जांच ,4. एंजाइम लिंक्ड immunosorbent परख (एलिसा), सतह plasmon अनुनाद (SPR) या क्वार्ट्ज क्रिस्टल microbalance (QCM) setups जैसे तरीकों के विपरीत, AFM एकल अणु (SMFS)5 और एकल कोशिका स्तर (SCFS) 6 पर बातचीत को मापने के लिए अनुमति देता है . इन प्रौद्योगिकियों पकड़ बांड की तरह बाध्यकारी तंत्र में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि उपज ई. कोलाई pilus प्रोटीन FimH mannose के साथ7, या मिलकर β-जिपर एस aureus से एफ एन बाध्यकारी प्रोटीन द्वारा गठित दोहराता के साथ बातचीत के लिए मिला 8एफ एन के लिए बाध्यकारी पर । हम हाल ही में यह दिखाने में सक्षम थे कि pilus-1 adhesin RrgA9,10 ग्राम से पॉजिटिव जीवाणु स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया (S. निमोनिया)11 को fibronectin12 में बांध कर अपने दो टर्मिनल डोमेन के साथ । यह एक नया दो डोमेन बाइंडिंग प्रणाली है जो मिलकर β-जिपर से अलग है और piliated pneumococci सक्षम करने के लिए फार्म और fibronectin युक्त मेजबान13सतहों के लिए एक क्षणिक संपर्क बनाए रखने के लिए कर सकते है पता चला ।
SMFS प्रयोगों की सफलता ठोस सतहों और AFM सुझावों पर कार्यात्मक और गैर-अणुओं के देशी स्थिरीकरण पर निर्भर करता है । के रूप में उच्च बलों SMFS माप के दौरान हो सकता है, प्रोटीन अधिमानतः सतह के लिए युग्मित किया जाना चाहिए covalently । वहां प्रोटीन और अंय जैव अणुओं के स्थिरीकरण के लिए विभिंन युग्मन तरीकों की एक बड़ी संख्या में हैं, साथ ही साथ पूरी कोशिकाओं पर (अकार्बनिक) ठोस सतहों, नैनो कणों और अंय साहित्य में वर्णित उपकरणों14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. इन प्रोटोकॉल अक्सर खतरनाक पदार्थों का उपयोग करने के लिए, प्रदर्शन और/या विशेष उपकरण (जैसे, प्लाज्मा क्लीनर) की आवश्यकता है मुश्किल कर रहे हैं । कांच के लिए कुछ अणुओं के लिए एक सरल तरीका है एक तरफ एक silane-प्रतिक्रियाशील समूह और उनके दूसरे पक्ष पर एक अमीन-प्रतिक्रियाशील समूह के साथ heterobifunctional crosslinkers का एक मोटा बहुलक परत संलग्न है । आवेदन पर निर्भर करता है, युग्मन एजेंटों लचीला हाइड्रो चर लंबाई के कार्बन श्रृंखला, जैसे, polyethylenglycol (खूंटी) शामिल कर सकते हैं । वे संशोधित सतहों के गैर विशिष्ट बातचीत को दबाने (जैसे, hydrophobic, इलेक्ट्रोस्टैटिक और वान-डेर-Waals बातचीत) और युग्मित अणु रोटेशन स्वतंत्रता प्रदान कर सकते हैं ।
यहां, हम एक या एक से अधिक मुक्त अमीनो समूहों (-NH2) युक्त प्रोटीन की आबंध युग्मन के लिए एक सामांय प्रोटोकॉल का वर्णन कांच सतहों और सिलिकॉन नाइट्राइड AFM युक्तियां एक heterobifunctional ethoxy silane-खूंटी-carboxyl (-COOH) के माध्यम से । इस प्रोटोकॉल SMFS प्रयोगों, जो RrgA और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन एफ एन के संपर्क के आधार पर उदाहरण है में इस्तेमाल किया जा सकता है (एक सिंहावलोकन के लिए 1 चित्र देखें) ।
पहला कदम सतह28,29,30,31के silanization है । यह युग्मन एजेंट के ethoxy समूहों के hydrolysis के क्रम में उच्च प्रतिक्रियाशील SiOH समूहों के रूप में शामिल है । इन सब्सट्रेट पर SiOH समूहों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं । एक प्राथमिक संघनित्र कदम में, इन silanols फार्म हाइड्रोजन बांड और सब्सट्रेट पर फैल गया । एक माध्यमिक संघनित्र प्रतिक्रिया में (जो आम तौर पर गर्मी या निर्वात के लिए पानी निकालने की आवश्यकता है), siloxane बांड का गठन कर रहे हैं । यह एक covalently संलग्न organo-silane परत में परिणाम है ।
दूसरे चरण कार्यात्मक (-COOH) समूहों जो बहुलक३२से विस्तार करने के लिए प्रोटीन के युग्मन है । सबसे पहले, एसिड एक प्रतिक्रियाशील N-hydroxysuccinimid (एन एच एस) एस्टर मध्यवर्ती, जो अच्छी तरह से स्थापित एन एस सी के माध्यम से प्राप्त की है (1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid रसायन विज्ञान३३ और बहोत nucleophilic प्रतिस्थापन करने के लिए परिवर्तित हो जाता है अंत में प्रोटीन पर प्राथमिक अमीन के साथ एक के बीच संबंध बनाने के लिए ।
इस तरह, RrgA एक यादृच्छिक अभिविंयास में सिलिकॉन नाइट्राइड AFM युक्तियां और ग्लास सब्सट्रेट करने के लिए मानव एफ एन के लिए युग्मित किया गया था और उनके संपर्क बलों एकल अणु स्तर पर विश्लेषण किया गया । हमारे परिणाम बताते है कि वर्णित सतह रसायन विज्ञान के कांच की सतह पर एफ एन के एक समरूप वितरण की ओर जाता है और टिप पर RrgA की एक उचित एकाग्रता के लिए, SMFS माप के दौरान बातचीत की घटनाओं के 20% तक के लक्ष्य मूल्य से स्पष्ट है । इस रसायन विज्ञान गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि बातचीत कम कर देता है, डेटा अधिग्रहण के दौरान थोड़ा परिवर्तन के अधीन है और इसलिए उत्कृष्ट सटीक SMFS प्रयोगों के लिए अनुकूल है ।
AFM आधारित SMFS की शुरूआत के बाद से, यह एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक में विकसित करने के लिए सीधे व्यक्तिगत प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और अंय अणुओं3,4,5के इंट्रा और आणविक बलों की जांच । सफल SMFS प्रयोगों के लिए, एक उपयुक्त सतह युग्मन रणनीति एक शर्त है । प्राकृतिक और सिंथेटिक पॉलिमर में intramolecular बलों की जांच करने के लिए, पॉलिमर सीधे सब्सट्रेट सतह और AFM टिप३६,३८,३९,४०,४१करने के लिए युग्मित किया जा सकता है । इस तरह के आणविक बांड के रूप में अंतर-आणविक बातचीत, की जांच के लिए, तथापि, यह सलाह दी जाती है कि ऐसे hetero-bifunctional खूंटी लिंकर्स, या पॉलीपेप्टाइड जंजीरों के रूप में लचीला linker अणुओं का उपयोग करने के लिए AFM टिप और बातचीत भागीदारों संलग्न करने के लिए सब्सट्रेट सतह, आदेश में बाध्यकारी भागीदारों के सही अभिविन्यास के लिए अनुमति देने के लिए, कम दूरी की सतह बलों को दूर करने के लिए और विकार से बचने के लिए और प्रोटीन का खुलासा21,22,23, 24,25,26,27,४२. इसलिए हम hetero-bifunctional खूंटी स्पेसिंग का उपयोग कर अपने सुलभ प्राथमिक अमीन के माध्यम से प्रोटीन के आबंध स्थिरीकरण के लिए एक सरल और सीधे आगे प्रोटोकॉल का वर्णन किया ।
हम एस निमोनिया और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन एफ एन से adhesin RrgA के बीच बातचीत बलों की जांच के साथ अपनी प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया, के रूप में हाल ही में विस्तार में वर्णित13कहीं ।
भूतल रसायन विज्ञान अच्छी तरह से स्थापित है और विश्लेषण किया गया है और इसी तरह के दृष्टिकोण सफलतापूर्वक एकाधिक SMFS प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है19,४२,४३,४४,४५. silylether सतह के लिए silane बहुलक युग्मन के लिए इस्तेमाल किया, hydrolysis के अधीन है । hydrolysis की डिग्री का गठन siloxane बांड की राशि पर निर्भर करता है, जो silanization प्रक्रिया के दौरान नियंत्रित किया जा सकता है । यदि उच्च संपर्क बलों (≥ १००० pN) SMFS मापन के दौरान की उंमीद कर रहे हैं, silanization भाप के माध्यम से किया जाना चाहिए चरण30 बयान जो siloxanes की एक सतत परत के गठन में परिणाम । कई प्रयोगों के लिए के रूप में (जैसे, कई प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत), संपर्क बलों कुछ सौ pN की सीमा में हैं, और वर्णित प्रक्रिया, जिसमें siloxane गठन एक जलीय चरण और असीम से जमाव से बाहर किया जाता है organo-silanes सोच से इथेनॉल (कदम 1.1.7) गर्मी (कदम 1.1.8) के साथ इलाज के बाद के साथ धोया जाता है, पर्याप्त है ।
एक और महत्वपूर्ण कदम शेष EDC और (1.2.3 कदम) सतह से एन एच एस अणुओं को धो रहा है, के रूप में बचे प्रोटीन पर carboxyl समूहों के सक्रियण के लिए नेतृत्व करेंगे । यह या तो एक ही सतह पर प्रोटीन के crosslinking में परिणाम हो सकता है, जो उनकी कार्यक्षमता या covalently जोड़े को विपरीत सतह पर अंय प्रोटीन के लिए प्रोटीन सक्रिय बदल सकते हैं । यह सतह और AFM टिप है, जो उच्च टूटना बलों में परिणाम संभवतः डोमेन खुलासा के साथ के बीच प्रोटीन की clamping के लिए नेतृत्व कर सकते है (चित्र 3 बी, ट्रेस 1, 4 और 5, एफ एन डोमेन का खुलासा)४६। एक ही समस्या हो सकती है, अगर खूंटी स्पेसर के सक्रिय एन एच एस एस्टर संतृप्त छोड़ दिया जाता है । इसलिए, Tris के साथ मशीन खारा बफर की सिफारिश की है (1.2.6 कदम), Tris के प्राथमिक अमीन के रूप में शेष अमीनो प्रतिक्रियाशील समूहों बुझती है ।
प्रोटोकॉल stepwise के बाद silanized ग्लास सतह पर एफ एन के एक समरूप वितरण की ओर जाता है ( चित्रा 2देखें), प्रोटीन का एक dimeric रूप छोड़ने । इस समाधान में एफ एन ´ एस संरचना जैसा दिखता है और अंय नमूना३७सतहों पर पिछले AFM डेटा के अनुरूप है । इसके अलावा, AFM टिप पर RrgA की एक उचित एकाग्रता प्राप्त की है, जो SMFS माप के दौरान अच्छी तरह से परिभाषित बातचीत की घटनाओं के ~ 20% का एक लक्ष्य मूल्य उत्पंन करता है (चित्रा 3 और चित्रा 4) । एक और सुरुचिपूर्ण तरीका है प्रोटीन एकाग्रता और/या गर्मी के समय अलग करने के अलावा नमूना सब्सट्रेट और ब्रैकट टिप करने के लिए युग्मित अणुओं की राशि को नियंत्रित करने के लिए विभिन्न माध्यमिक कार्यात्मक समूहों के साथ silane-एजेंटों का संयोजन है । खूंटी-पॉलिमर से विस्तार करने वाले प्रोटीन रिएक्टिव समूहों का अनुपात बदलकर, मैटीरियल प्रोटीन की संख्या15,16,17,18नियंत्रित की जा सकती है ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल भी अन्य-एनएच2 अणुओं से युक्त या कांच और सिलिकॉन नाइट्राइड के अलावा अन्य सिलिकॉन ऑक्साइड सतह के लिए कुछ प्रोटीन के लिए समायोजित किया जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रोटीन डिजाइन के आधार पर, अमीन प्रतिक्रियाशील carboxyl समूह एक sulfhydryl प्रतिक्रियाशील समूह (जैसे, maleimide या ऑर्थो-pyridyl डाइसल्फ़ाइड) के लिए अपने मुक्त-एसएच समूहों के माध्यम से प्रोटीन दंपति को बदला जा सकता है । एफ एन के लिए, एक पूर्वनिर्धारित अभिविंयास13,17,20में यह परिणाम है ।
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल के लिए विभिंन आवश्यकताओं की सेवा समायोजित किया जा सकता है और एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों के अलावा अंय भौतिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है ।
The authors have nothing to disclose.
टीबी और पारा यूरोपीय अनुसंधान परिषद “Cellufuel, उंनत अनुदान No. २९४४३८” के माध्यम से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । HCS Innovationsallianz Technofunktionale प्रोटीन (TeFuProt) के माध्यम से शिक्षा और अनुसंधान के लिए संघीय मंत्रालय से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है, एसएस विज्ञान और शिक्षा के लिए Bavarian राज्य मंत्रालय से वित्तीय सहायता स्वीकार शोध फोकस के माध्यम से “Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe-खिचड़ी” । तकनीकी समर्थन के लिए हम आनाकानी Hasselberg-क्रिस्टोफ और मार्टिना Hörig को धन्यवाद
Material | |||
2-Propanol | Carl Roth | 6752 | |
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | 03450 | EDC |
Acetic acid | Carl Roth | 3738 | 100 %; analytical purity |
Doubly distilled water | |||
Ethanol | Carl Roth | 9065 | ≥ 99.8 %; analytical purity |
Ethoxy silane polyethylene glycol acid | Nanocs | PG2-CASL-5k | 5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3 |
Hydrochloric acid | Carl Roth | X896 | 32 % |
N-Hydroxysuccinimid | Merck | 804518 | NHS; for synthesis |
Phosphate Buffered Saline – Dulbecco | Biochrom | L1825 | PBS |
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma | Sigma-Aldrich | F1056 | |
Probe molecule e.g. RrgA | Produced in laboratory | ||
Sodiumchlorid | Carl Roth | 9265 | NaCl |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Carl Roth | AE15 | ≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Beakers | |||
Glass cutter | |||
Glass slides | Carl Roth | 0656 | |
Inert gas desiccator | Sicco | ||
Inverted Microscope – Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | ||
JPK NanoWizard 1 | JPK Instruments | ||
JPK NanoWizard SPM and DP software | JPK Instruments | ||
Laboratory oven | Binder | ||
Magnetic stirrer | IKA | ||
Micro spatula | |||
Microcentrifuge tubes | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
Parafilm M | Brand | 701606 | |
Petri dishes | |||
pH-meter | Knick | ||
Pipettes | Starlab | 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl | |
Precision balance | Acculab | ||
Silicon nitride cantilever – MLCT | Bruker AXS S.A.S | Spring constant ≤ 100 pN/nm | |
Sonication bath | Bandelin | ||
Staining jar | |||
Stereo microscope – Zeiss Stemi | Zeiss | ||
Stir bar | |||
Kimtech science precision wipes | Kimberly-Clark | ||
Twezzers | |||
UV PenRay | UVP, LLC | 90-0012-01 | Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm |
Vacuum desiccator | |||
Vacuum pump | |||
Vortex mixer | VWR | ||
Weighing paper | Carl Roth | TP64 |