Denne protokollen beskriver kovalente immobilisering av proteiner med en heterobifunctional silane kopling agent silisium oksid overflater laget for atomic force mikroskopi basert ett molekyl force spektroskopi som er eksemplifisert ved den samspillet av RrgA (pilus-1 tips adhesin av S. pneumoniae) med fibronectin.
De siste årene basert atomic force mikroskopi (AFM) ett molekyl force spektroskopi (SMFS) utvidet vår forståelse av molekylære egenskaper og funksjoner. Det ga oss mulighet til å utforske et mangfold av Biofysiske mekanismer, f.ekshvordan bakteriell adhesins binde til verten overflate reseptorer i mer detalj. Blant andre faktorer avhenger SMFS eksperimenter av funksjonelle og innfødt immobilisering av biomolecules rundt på solide flater og AFM tips. Her beskriver vi en enkel protokoll for kovalente koblingen av proteiner til silisium flater med silane-PEG-carboxyls og veletablerte N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) kjemi i rekkefølge å utforske samspillet av pilus-1 adhesin RrgA fra Gram-positive bakterien Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) med ekstracellulær matrix proteiner fibronectin (Fn). Våre resultater viser at til overflate functionalization fører til en homogen fordeling av Fn på glassplaten og en passende konsentrasjonen av RrgA på AFM cantilever spissen, tydelig målverdien opptil 20% av samhandling hendelser i SMFS målinger og avslørte at RrgA binder til Fn med en gjennomsnittlig kraft av 52 pN. Protokollen kan justeres par via bestemte gratis thiol områdegrupper. Dette resulterer i et forhåndsdefinert protein eller molekyl retning og er egnet for andre Biofysiske programmer i tillegg til SMFS.
Foruten optisk og magnetiske pinsetter, atomic force mikroskopet (AFM)1,2 har dukket opp som et nyttig verktøy for å analysere og manipulere molekyler og undersøke deres egenskaper og funksjoner, inkludert deres respons på ytre tvang3 ,4. I motsetning til metoder som enzym koblede immunosorbent analysen (ELISA), overflaten plasmon resonans (SPR) eller kvartskrystall microbalance (QCM) oppsett, AFM kan måle samhandlinger på ett molekyl (SMFS)5 og enkelt cellenivå (SCFS)6 . Disse teknologiene gitt verdifull innsikt i bindingen mekanismer som fange obligasjoner funnet for samspillet av E. coli pilus protein FimH med mannose7eller tandem β-glidelåsen gjentar dannet av Fn bindende proteiner fra S. aureus ved binding til Fn8. Vi hadde nylig viser at pilus-1 adhesin RrgA9,10 fra Gram-positive bakterien Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 er i stand til å binde til fibronectin12 med sine to terminal domener. Dette avslørt en ny to-domene bindende mekanisme som skiller seg fra tandem β-glidelås og kan aktivere piliated pneumococci å danne og opprettholde en forbigående kontakt til fibronectin inneholder vert overflater13.
SMFS eksperimenter avhenger kritisk av funksjonelle og innfødt immobilisering av biomolecules på faste flater og AFM tips. Som høy styrker kan oppstå under SMFS mål, bør proteiner fortrinnsvis covalently kobles til overflaten. Det finnes et stort antall forskjellige kopling metoder for immobilisering av proteiner og andre biomolecules, i tillegg til hele celler (uorganiske) solide flater, nano-partikler og andre enheter som er beskrevet i den litteratur14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Disse protokollene ofte gjør bruk av skadelige stoffer, er vanskelig å utføre og spesialutstyr (f.eks, plasma renere). En enkel måte å par molekyler til glass er knytte et tykkere polymer lag av heterobifunctional crosslinkers med en silane-reaktive group på den ene siden og en Amin-reaktive group på deres andre siden. Avhengig av programmet, kopling agenter kan omfatte fleksible hydrokarbon-kjeder av variabel lengde, f.eks., polyethylenglycol (PEG). De undertrykker ikke-spesifikke interaksjoner av endrede overflater (f.ekshydrofobe, elektrostatiske og van der Waals vekselsvirkningene) og oppgir kombinert molekyl roterende frihet.
Her beskriver vi en generell protokoll for kovalente koblingen av proteiner som inneholder én eller flere gratis amino grupper (-NH2) på glass flater og silicon nitride AFM tips via en heterobifunctional ethoxy silane-PEG-carboxyl (-COOH). Denne protokollen kan brukes i SMFS eksperimenter, som er eksemplifisert basert på samspillet av RrgA og ekstracellulær matrix proteiner Fn (se figur 1 for en oversikt).
Det første trinnet er silanization overflaten28,29,30,31. Det innebærer hydrolyse av ethoxy grupper av kopling agent for å danne svært reaktive SiOH grupper. Dette kan reagere med SiOH grupper på underlaget. I en primær kondens steg, disse silanols skjemaet hydrogenbindinger og spredt på underlaget. I en sekundær kondens reaksjon (som vanligvis krever varme eller vakuum fjerne vann), siloxane obligasjoner er dannet. Dette resulterer i et covalently festet organo-silane lag.
Det andre trinnet er koblingen av proteiner til den funksjonelle (-COOH) som strekker seg fra polymer32. Først syre konverteres til en reaktiv N-hydroxysuccinimid (NHS) ester mellomliggende, som oppnås gjennom veletablerte NHS/EDC (1-etyl – 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid kjemi33 og gjennomgår nukleofil substitusjon endelig form en amid bånd med primære aminer på proteiner.
Dette RrgA ble kombinert til silicon nitride AFM tips og menneskelige Fn til glass underlag i en tilfeldig orientering og deres samspill styrker ble analysert på ett molekyl nivå. Våre resultater viser at beskrevet overflatekjemi fører til en homogen fordeling av Fn på glassplaten og en passende konsentrasjonen av RrgA på spissen, tydelig målverdien opptil 20% av samhandling hendelser i SMFS målinger. Denne kjemien reduserer ikke-spesifikke bakgrunnen interaksjoner, kan liten endring under datainnsamling og er derfor perfekt egnet for presis SMFS eksperimenter.
Siden introduksjonen av AFM basert SMFS, det utviklet seg til en mye brukt teknikk å direkte undersøke intra- og intermolekylære kreftene personlige proteiner og nukleinsyrer andre biomolecules3,4,5. For vellykket SMFS eksperimenter er en passende kobling strategi en forutsetning. For å undersøke intramolekylære kreftene i naturlige og syntetiske polymerer, kan polymerer være direkte koblet til substrat overflate og AFM tips36,38,39,40,41. For etterforskningen av Inter molekylære interaksjoner, for eksempel molekylær bånd, men det er tilrådelig å bruke fleksible koblingsfunksjonalitet molekyler som hetero-bifunctional pinne linkers eller polypeptid kjeder, knytte samhandling partnerne til AFM spissen og substrat overflate, for å tillate riktig retning av bindende, å overvinne kort rekkevidde overflaten styrker og unngå rødsprit og utfolder proteiner21,22,23, 24,25,26,27,42. Vi derfor beskrev en enkelt og likefrem protokoll for kovalente immobilisering av proteiner via deres tilgjengelige primære aminer bruke hetero-bifunctional pinne avstandsstykker.
Vi viste brukbarheten med etterforskningen av samspillet styrker mellom adhesin RrgA fra S. pneumoniae og ekstracellulær matrix protein Fn, som nylig beskrevet i detalj andre steder13.
Overflatekjemi er godt etablert og analysert og lignende tilnærminger har blitt brukt i flere SMFS eksperimenter19,42,43,44,45. Silylether brukes til å koble den silane polymer til overflaten, er hydrolyse. Graden av hydrolyse avhenger av mengden dannet siloxane obligasjoner, hvilke kan kontrollert under silanization prosessen. Hvis høy interaksjon styrker (≥ 1000 pN) forventes i løpet SMFS mål, skal silanization utføres via damp-fase deponering30 som resulterer i dannelsen av en kontinuerlig lag av siloxanes. Som for mange eksperimenter (f.eks, mange protein-protein interaksjoner) er samhandling styrkene i et par hundre pN, og beskrives fremgangsmåten som siloxane formasjon er utført av nedfall fra en vandige fasen og ubundet organo-silanes er nøye vaskes av med etanol (trinn 1.1.7) etterfulgt av herding med varme (trinn 1.1.8), er tilstrekkelig.
Et annet viktig skritt er å vaske resten EDC NHS molekyler av overflaten (trinn 1.2.3), som restene vil føre til aktivering av carboxyl grupper på proteiner. Dette kan enten føre crosslinking proteiner på samme overflaten, som kan endre funksjonaliteten eller covalently par aktivert proteiner til andre proteiner på det motsatte overflaten. Dette kan føre til fastklemming av proteiner mellom overflaten og AFM spissen, som resulterer i høyt ruptur styrker muligens ledsaget av domenet utspiller seg (se figur 3b, spor 1, 4 og 5, unfolding Fn domener)46. Det samme problemet kan oppstå hvis de aktive NHS estere av PEG avstandsstykket er igjen umettet. Inkubasjon med Tris bufret saltvann anbefales derfor (trinn 1.2.6), som primære Amin i Tris slukker gjenværende amino reaktive gruppene.
Følger protokollen gradvis fører til en homogen fordeling av Fn på silanized glass overflaten (se figur 2), forlater en dimeric form av protein. Dette ligner Fn´s strukturen i løsning og er i samsvar med tidligere AFM data på andre prøve overflater37. I tillegg er en passende konsentrasjonen av RrgA på AFM spissen oppnådd, som genererer en målverdi ~ 20% av veldefinerte samhandling hendelser i SMFS målinger (Figur 3 og Figur 4). En elegant måte å kontrollere mengden av molekyler kombinert til eksempel substrat og cantilever spissen Dessuten varierende protein konsentrasjon og/eller inkubasjon ganger, er en kombinasjon av silane-agenter med ulike sekundære funksjonsgruppene. Ved å endre forholdet mellom protein reaktive grupper fra PEG-polymer, kan antall immobilisert proteiner være kontrollert15,16,17,18.
Protokollen beskrevet her kan også brukes til nakkens andre -NH2 inneholder molekyler eller justeres par proteiner andre silisium oksid overflaten foruten glass og silicon nitride. Avhengig av protein design, gruppen Amin reaktive carboxyl kan endres til en sulfhydryl reaktive group (f.eks, maleimide eller Orto-pyridyl disulfide) å protein via dens ledig-SH grupper. For Fn resulterer dette i en forhåndsdefinert retning13,17,20.
I sammendraget, denne protokollen kan justeres for å tjene ulike krav og er egnet for andre Biofysiske programmer foruten ett molekyl force spektroskopi eksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
TB og HG erkjenner økonomisk støtte gjennom europeiske forskningsråd “Cellufuel, avanserte Grant nr 294438”. HCS erkjenner økonomisk støtte fra det føderale ministeriet for utdanning og forskning gjennom Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt), SS erkjenner økonomisk støtte fra bayerske staten departementet for vitenskap og utdanning gjennom fokus “Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe – CANTER”. Vi takker Conny Hasselberg-Christoph og Martina Hörig kundestøtte
Material | |||
2-Propanol | Carl Roth | 6752 | |
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | 03450 | EDC |
Acetic acid | Carl Roth | 3738 | 100 %; analytical purity |
Doubly distilled water | |||
Ethanol | Carl Roth | 9065 | ≥ 99.8 %; analytical purity |
Ethoxy silane polyethylene glycol acid | Nanocs | PG2-CASL-5k | 5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3 |
Hydrochloric acid | Carl Roth | X896 | 32 % |
N-Hydroxysuccinimid | Merck | 804518 | NHS; for synthesis |
Phosphate Buffered Saline – Dulbecco | Biochrom | L1825 | PBS |
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma | Sigma-Aldrich | F1056 | |
Probe molecule e.g. RrgA | Produced in laboratory | ||
Sodiumchlorid | Carl Roth | 9265 | NaCl |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Carl Roth | AE15 | ≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Beakers | |||
Glass cutter | |||
Glass slides | Carl Roth | 0656 | |
Inert gas desiccator | Sicco | ||
Inverted Microscope – Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | ||
JPK NanoWizard 1 | JPK Instruments | ||
JPK NanoWizard SPM and DP software | JPK Instruments | ||
Laboratory oven | Binder | ||
Magnetic stirrer | IKA | ||
Micro spatula | |||
Microcentrifuge tubes | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
Parafilm M | Brand | 701606 | |
Petri dishes | |||
pH-meter | Knick | ||
Pipettes | Starlab | 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl | |
Precision balance | Acculab | ||
Silicon nitride cantilever – MLCT | Bruker AXS S.A.S | Spring constant ≤ 100 pN/nm | |
Sonication bath | Bandelin | ||
Staining jar | |||
Stereo microscope – Zeiss Stemi | Zeiss | ||
Stir bar | |||
Kimtech science precision wipes | Kimberly-Clark | ||
Twezzers | |||
UV PenRay | UVP, LLC | 90-0012-01 | Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm |
Vacuum desiccator | |||
Vacuum pump | |||
Vortex mixer | VWR | ||
Weighing paper | Carl Roth | TP64 |