Kovalente immobilisering av proteiner for ett molekyl Force spektroskopi

Summary

Denne protokollen beskriver kovalente immobilisering av proteiner med en heterobifunctional silane kopling agent silisium oksid overflater laget for atomic force mikroskopi basert ett molekyl force spektroskopi som er eksemplifisert ved den samspillet av RrgA (pilus-1 tips adhesin av S. pneumoniae) med fibronectin.

Abstract

De siste årene basert atomic force mikroskopi (AFM) ett molekyl force spektroskopi (SMFS) utvidet vår forståelse av molekylære egenskaper og funksjoner. Det ga oss mulighet til å utforske et mangfold av Biofysiske mekanismer, f.ekshvordan bakteriell adhesins binde til verten overflate reseptorer i mer detalj. Blant andre faktorer avhenger SMFS eksperimenter av funksjonelle og innfødt immobilisering av biomolecules rundt på solide flater og AFM tips. Her beskriver vi en enkel protokoll for kovalente koblingen av proteiner til silisium flater med silane-PEG-carboxyls og veletablerte N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) kjemi i rekkefølge å utforske samspillet av pilus-1 adhesin RrgA fra Gram-positive bakterien Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) med ekstracellulær matrix proteiner fibronectin (Fn). Våre resultater viser at til overflate functionalization fører til en homogen fordeling av Fn på glassplaten og en passende konsentrasjonen av RrgA på AFM cantilever spissen, tydelig målverdien opptil 20% av samhandling hendelser i SMFS målinger og avslørte at RrgA binder til Fn med en gjennomsnittlig kraft av 52 pN. Protokollen kan justeres par via bestemte gratis thiol områdegrupper. Dette resulterer i et forhåndsdefinert protein eller molekyl retning og er egnet for andre Biofysiske programmer i tillegg til SMFS.

Introduction

Foruten optisk og magnetiske pinsetter, atomic force mikroskopet (AFM)^1,2 har dukket opp som et nyttig verktøy for å analysere og manipulere molekyler og undersøke deres egenskaper og funksjoner, inkludert deres respons på ytre tvang^{3 ,4}. I motsetning til metoder som enzym koblede immunosorbent analysen (ELISA), overflaten plasmon resonans (SPR) eller kvartskrystall microbalance (QCM) oppsett, AFM kan måle samhandlinger på ett molekyl (SMFS)⁵ og enkelt cellenivå (SCFS)⁶ . Disse teknologiene gitt verdifull innsikt i bindingen mekanismer som fange obligasjoner funnet for samspillet av E. coli pilus protein FimH med mannose⁷eller tandem β-glidelåsen gjentar dannet av Fn bindende proteiner fra S. aureus ved binding til Fn⁸. Vi hadde nylig viser at pilus-1 adhesin RrgA^9,10 fra Gram-positive bakterien Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)¹¹ er i stand til å binde til fibronectin¹² med sine to terminal domener. Dette avslørt en ny to-domene bindende mekanisme som skiller seg fra tandem β-glidelås og kan aktivere piliated pneumococci å danne og opprettholde en forbigående kontakt til fibronectin inneholder vert overflater¹³.

SMFS eksperimenter avhenger kritisk av funksjonelle og innfødt immobilisering av biomolecules på faste flater og AFM tips. Som høy styrker kan oppstå under SMFS mål, bør proteiner fortrinnsvis covalently kobles til overflaten. Det finnes et stort antall forskjellige kopling metoder for immobilisering av proteiner og andre biomolecules, i tillegg til hele celler (uorganiske) solide flater, nano-partikler og andre enheter som er beskrevet i den litteratur^{14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27}. Disse protokollene ofte gjør bruk av skadelige stoffer, er vanskelig å utføre og spesialutstyr (f.eks, plasma renere). En enkel måte å par molekyler til glass er knytte et tykkere polymer lag av heterobifunctional crosslinkers med en silane-reaktive group på den ene siden og en Amin-reaktive group på deres andre siden. Avhengig av programmet, kopling agenter kan omfatte fleksible hydrokarbon-kjeder av variabel lengde, f.eks., polyethylenglycol (PEG). De undertrykker ikke-spesifikke interaksjoner av endrede overflater (f.ekshydrofobe, elektrostatiske og van der Waals vekselsvirkningene) og oppgir kombinert molekyl roterende frihet.

Her beskriver vi en generell protokoll for kovalente koblingen av proteiner som inneholder én eller flere gratis amino grupper (-NH₂) på glass flater og silicon nitride AFM tips via en heterobifunctional ethoxy silane-PEG-carboxyl (-COOH). Denne protokollen kan brukes i SMFS eksperimenter, som er eksemplifisert basert på samspillet av RrgA og ekstracellulær matrix proteiner Fn (se figur 1 for en oversikt).

Det første trinnet er silanization overflaten^28,29,30,31. Det innebærer hydrolyse av ethoxy grupper av kopling agent for å danne svært reaktive SiOH grupper. Dette kan reagere med SiOH grupper på underlaget. I en primær kondens steg, disse silanols skjemaet hydrogenbindinger og spredt på underlaget. I en sekundær kondens reaksjon (som vanligvis krever varme eller vakuum fjerne vann), siloxane obligasjoner er dannet. Dette resulterer i et covalently festet organo-silane lag.

Det andre trinnet er koblingen av proteiner til den funksjonelle (-COOH) som strekker seg fra polymer³². Først syre konverteres til en reaktiv N-hydroxysuccinimid (NHS) ester mellomliggende, som oppnås gjennom veletablerte NHS/EDC (1-etyl – 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid kjemi³³ og gjennomgår nukleofil substitusjon endelig form en amid bånd med primære aminer på proteiner.

Dette RrgA ble kombinert til silicon nitride AFM tips og menneskelige Fn til glass underlag i en tilfeldig orientering og deres samspill styrker ble analysert på ett molekyl nivå. Våre resultater viser at beskrevet overflatekjemi fører til en homogen fordeling av Fn på glassplaten og en passende konsentrasjonen av RrgA på spissen, tydelig målverdien opptil 20% av samhandling hendelser i SMFS målinger. Denne kjemien reduserer ikke-spesifikke bakgrunnen interaksjoner, kan liten endring under datainnsamling og er derfor perfekt egnet for presis SMFS eksperimenter.

Protocol

1. immobilisering av proteiner via funksjonelle Silane kopling agenter Merk: Figur 1 gir en oversikt over overflatekjemi brukt i denne protokollen. Advarsel: I den følgende protokollen, ulike kjemikalier med etsende og hud irriterende egenskaper brukes. Ha tilstrekkelig (syre-resistente) hansker, vernebriller og laboratoriet frakk og arbeide under avtrekksvifte klargjøring løsninger for å unngå innånding av damp. Functionalization glassflater og silicon nitride cantilever med silane kopling agenter Fjern grov støv og forurensing fra glass lysbilder med isopropanol og lofri presisjon tørker og skjær lysbildene i ønsket størrelse (valgfritt).Merk: Ved glass, solid overflaten kan være silika, kvarts og oksider av aluminium, kobber, tinn, Titan, jern, krom, zirkonium, nikkel og sink.FORSIKTIG: Kutte glass lysbilder kan forårsake skarpe kanter. Stedet glasset lysbilder i en flekker krukke fylt med saltsyre (33% HCl) fortynnet med dobbelt destillert vann (ddH2O) 3-5% (v/v), lukke glasset med riktig lokk og plasser den i ultralydbad for 90 min ved romtemperatur.Merk: Brukte glasset har en diameter på 6 cm og en tilnærmet størrelse 65-70 ml. En passende mengde utvannet HCl i glasset er 50 mL inneholder 5 mL 33% HCl og 45 mL ddH2O. HCl effektivt fjerner uforpliktende metall ioner, spesielt natrium, kalium og kalsium og reduseres silikonet for å produsere en hydroksyl mettet glassoverflaten.FORSIKTIG: HCl er etsende og hud irriterende. Bruk tilstrekkelig syrefast hansker, vernebriller og laboratoriet strøk og arbeide under avtrekksvifte mens han forberedte løsningen for å unngå innånding av damp. Plass silicon nitride AFM cantilever sonder på en ren objektglass spissen vendt oppover og irradiate med UV lys ovenfra i minst 90 min.Merk: For enkel molekyl force spektroskopi, utkragning med en nominell våren konstant av 0,01 til 0,1 N m-1 er egnet. Bestråling av cantilever overflaten med UV lys fjerner organisk forurensning, hovedsakelig fett stoffer, og gjøre det hydrofile på én side. Hvis den andre siden er sterkt forurenset – som bør ikke være tilfelle, eller hvis cantilever sonder brukes friske leverandørenes gang – det kan påvirke SMFS målingen. En grundig rengjøring av hele cantilever chip bruker piranha løsning, som har vært brukt i mange studier34, kan hjelpe.FORSIKTIG: UV lys er skadelig for øynene; bestråling av cantilever sonder bør derfor utføres i en UV lys ugjennomtrengelig kammer. Piranha løsningen er svært reaktive og kan brenne huden, papir og annet organisk materiale. Ikke bruk plastbeholdere. Hvis plassert i retter eller glass selv med små mengder organisk overflaten forurensing (f.eksfra tidligere bruk), kan den reagere raskt. Erstatt saltsyre i flekker glasset med ddH2O uten å la glassoverflaten tørr og sett glasset tilbake i ultralydbad for en annen 10 min. erstatte vannet to ganger for 10 min å riktig vaske saltsyre syre. I mellomtiden oppløse ethoxy (eller metoksy) silane polyetylenglykol syre (Si (OC2H5)3-PEG-COOH) i en blanding av etanol og ddH2O (v/v 95% / 5%, pH 4.6 justert med eddiksyre) til en siste konsentrasjon av 0,1 mg mL -1. Lagre løsningen hermetisk forseglet for å unngå fordampning av etanol.Merk: Silane kopling agenter er følsomme for fuktighet og temperatur. Derfor bør de oppbevares under inert gass (N2), lav temperatur (-20 ° C) og under tørre forhold. Før du åpner kolbe, sørg for at silanes har nådd romtemperatur for å minimere hydrering og dermed passivation reaktive grupper. Heterobifunctional pinne kopling agenter er tilgjengelig med mange ulike funksjonsgruppene og ulike spacer lengder. Tilfeldig immobilisering av proteiner via er deres gratis amino grupper (NH2), som beskrevet i denne protokollen, funksjonsgruppen tillegg til ethoxy/metoksy-silane en NHS ester. Ved kjøp av en silane agent med NHS ester, en enkel måte å få slike NHS ester er å aktivere en carboxyl gruppe (-COOH) med 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) og NHS (se 1.2.1. og 1.2.2.).FORSIKTIG: Etanol er brannfarlig og hud irriterende. Eddiksyre er brannfarlig og etsende. Ta vare ikke for å få reaktive silanes til huden eller i øynene. Ha tilstrekkelig hansker, vernebriller og laboratoriet frakk og arbeide under avtrekksvifte for å unngå innånding av damp. Hell silane løsningen i to separate Petri retter, plasser forberedt cantilever sonder og glass lysbilder i en Petriskål henholdsvis, forsegle hermetisk (f.eks parafilm) å unngå fordampning av etanol og ruge stasjonære for 90 min på romtemperatur.Merk: Den optimale størrelsen på Petriskål avhenger av antall cantilever sonder og størrelsen på glass lysbilder som skal være functionalized. En diameter for god håndtering og lav reagensvolum er 50-60 mm. For å unngå uønskede bøying hengende mens trenge gjennom luften vann grensesnittet hengende skal holdes i 90° vinkel i luft-vann-grensesnittet. Inkubasjonstiden for glass lysbilder (men ikke cantilever sonder) kan eventuelt utføres på en orbital shaker. Skyll cantilever og glass lysbilder i tre påfølgende kanner med ren etanol helt vaskes ubundet silane forbindelser.Merk: For å unngå uønskede bøying hengende mens trenge gjennom luften vann grensesnittet, hengende skal holdes i 90° vinkel. Plass functionalized glass lysbilder i flekker glasset og hengende på en ren objektglass og cure på 110 ° C i 30 min.Merk: Herding med varme induserer dannelsen av kovalente siloxane obligasjoner og fjerning av vann. Som glass lysbilder var bare functionalized på den ene siden, pass på å angi riktig siden belagt. Lagre silanized glass prøver og cantilever sonder i et vakuum desiccator i opptil en uke.Merk: Protokollen kan pauses her. Tilfeldig immobilisering av proteiner på silanized glass og silicon nitride cantileverMerk: For å unngå uønskede bøying hengende, cantilever sonden skal holdes i 90° vinkel mens gjennomtrengende luft-vann grensesnitt. Forberede en løsning som inneholder 42 mg mL-1 av EDC og 20 mg mL-1 NHS i standard fosfat bufret saltvann (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.4).FORSIKTIG: EDC er etsende og irriterende for huden og kan forårsake alvorlig øyeskade. Ha tilstrekkelig hansker, vernebriller og laboratoriet frakk. Dekker silane belagt glass lysbilder med løsningen og sette silanized cantilever sonder i en dråpe EDC/NHS løsningen og ruge i 10 min ved romtemperatur.Merk: For inkubasjonstiden for cantilever sonder, cantilever originalemballasjen er egnet. Å par proteiner via deres gratis amino grupper til carboxyls (-COOH) av heterobifunctional silane-pinne agenter, gruppen – COOH aktiveres med brukte EDC/NHS kjemi. EDC par NHS til karboksylsyre, danner en “stabile” NHS ester som gjør effektiv Bøyning til primære aminer på fysiologisk pH i neste trinn. Skyll cantilever og glass lysbildene grundig med PBS i tre påfølgende kanner for å helt vaske av overdreven EDC/NHS.Merk: Denne vask trinnet er avgjørende som gjenværende EDC/NHS kan krysskobling proteiner og endre dermed funksjonaliteten. Inkuber aktivert glass lysbilder med og hengende sonder i et slippverktøy for ønsket protein løsningen i en våt kammer ved romtemperatur. Protein konsentrasjon og inkubasjon tiden bør tilpasses å møte kravene av eksperimentet. En konsentrasjon mellom 0,5 til 1 mg mL-1 og inkubasjon fra 30 minutter til 2 h er generelt egnet for de fleste proteiner. Fibronectin (på objektglass) og pilus-1 tips protein RrgA (på cantilever), en molar konsentrasjon på 1,5 µM og 3 µM, henholdsvis, og en inkubasjon tid på 2 timer er tilstrekkelig. Vask glass lysbilder og hengende sonder grundig med PBS i tre påfølgende kanner for å vaske av ubundet proteiner. Mette gjenværende NHS ester med tris (hydroxymethyl)-aminomethan ved å plassere sonder i tris-bufret saltvann (SS, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6) for 20 min ved romtemperatur.Merk: Dette trinnet reduserer uønsket kovalente kopling av proteiner mellom functionalized overflaten AFM tips og glass, fordi amino grupper av Tris kan binde til gjenværende aktivert COOH gruppene i den cantilever og substrat overflaten. Vask glass lysbilder og hengende sonder grundig med PBS og lagre dem i separate Petri retter dekket i PBS til bruk.Merk: Prøvene skal tilberedes ferskt og brukt samme dag. 2. atomic Force mikroskopi basert ett molekyl Force spektroskopi Merk: I dette arbeidet, en atomic force mikroskop JPK instrumenter ble brukt og ups for å få kraft-avstand kurver ble definert med tvinge RampDesigner. Cantilever kalibrering med termisk støy metoden35Merk: For cantilever kalibrering, Følg trinn i håndboken til produsenten. De fleste cantilever leverandører staten en omtrentlig våren konstant, som er vanligvis beregnet fra nominell cantilever figuren (lengde, bredde, tykkelse) og er derfor ikke veldig pålitelig. Den riktige vår konstanten er avgjørende, er det tilrådelig å utføre cantilever kalibreringen beskrevet nedenfor i tre eksemplarer og bruke mener verdiene av optisk spaken følsomhet og vår konstant. Det kan være nyttig å registrere cantilever nedbøyning i Volt (V) under eksperimentet og konvertere betyr det å tvinge (pN) etterpå bruker optisk spaken følsomheten og vår konstante verdier. Vår konstant og optisk lever følsomheten kan bestemmes før og/eller etter eksperimentet som laser plasseringen ikke er endret på hengende (plasseringen av de gjenspeiles laseren kan justeres på photodiode). Fikse en rene objektglass på AFM eksempel holderen og dekke det med PBS buffer.Merk: Kalibreringen bør utføres på en hard overflate (f.eks, glass) og i samme bufferen som de faktiske eksperimentene. Fastsette forberedt cantilever sonden på cantilever innehaveren, plasserer den i AFM hodet og nøye våt hengende med en dråpe PBS buffer.Merk: Fukting hengende reduserer overflatespenning vises under penetrasjon i PBS bufferen på objektglass kalibrering og dermed uønskede bøying hengende. Sakte flytter hengende mot kalibrering overflaten til hengende er helt nedsenket i PBS bufferen, men fortsatt fra kalibrering overflaten. Bruke ovenfra optisk mikroskopet av AFM eller (hvis tilgjengelig) invertert mikroskopet under AFM plassere laser av AFM på baksiden av hengende. Plass laser spot nær slutten av hengende nær der spissen ligger.Merk: Laser stedet bør være nær slutten av hengende, men det bør fortsatt være helt på hengende. Hvis ingen optisk mikroskopet er tilgjengelig, bruker papir for synlig laserdioder eller en laser detektoren kort for infrarød laserdioder, sette det under AFM hodet og flytte laser stedet mot kanten av cantilever-chip, der utkragning finnes , til du ser stedet på papir eller detektor. Laser går parallelt med kanten. Når stedet forsvinner, er det en utliggerarm. Lineær utkragning, Flytt stedet mot slutten av spaken armen til det vises på papir/detektor kortet, og flytte den tilbake til det er igjen på spaken armen (forsvinner fra papir/kortet). For trekantede, plasser stedet midt mellom to armer hengende og flytte det mot slutten av hengende, før den forsvinner fra papir/kortet. Kontroller at du er i hengende ved å flytte spot vinkelrette på den lange aksen hengende. Juster plasseringen av fire kvadrant detektor photodiode av AFM slik at gjenspeiles laserstrålen er plassert i midten av photodiode.Merk: Fortsetter som følger: Bruk mikrometer skruene nær detektor diode flytte diode vannrett og loddrett retning, til summen signalet fra alle fire quadrants er maksimert. Deretter flytter dioden i vertikal retning, til loddrett nedbøyning signalet er null, og flytter dioden i horisontal retning, til laterale nedbøyning signalet er null. Silicon nitride utkragning vanligvis har en gull belegg og er derfor en med stålbase med to forskjellige koeffisientene til termisk ekspansjon. Dette resulterer i en termisk drift (tilsynelatende i loddrett nedbøyning signalet) spesielt i løsningen. For å redusere denne drift under målinger, la det hele systemet equilibrate i noen minutter før kalibreringen. Åpne kalibrering manager i AFM programvaren og kalibrere cantilever følsomhet og vår konstant hengende med metoden termisk støy som følger. Forsiktig tilnærming substrat overflate og registrere en kraft-avstand kurve. Bestemme optisk spaken følsomheten i nm/V ved å tilpasse en rett linje til den bratteste delen av retraksjon makt kurven, der spissen er i kontakt med substrat overflate. Følsomheten kan konvertere cantilever våren konstant til pN/nm.Merk: Skråningen av retraksjon kurven er piezo reise avstanden vs. endringen i photodiode spenning (målt i nm/V). Registrere flere termisk støy spectra hengende med cantilever ca 100 µm eller mer fra overflaten for å utelukke enhver overflate demping. Bestemme vår konstant hengende i pN/V ved å montere en harmonisk oscillator av AFM programvaren til termisk støy spectra. Sakte trekke hengende og trekke det fra løsningen. Erstatning glassplaten brukes for cantilever kalibrering med eksempel overflaten immobilisert proteiner. Kontroller at hengende og prøve overflaten (og dermed proteiner) ikke tørr mens du endrer glass lysbilder. Samhandling tvinge eksperimenter på enkelt protein nivå Sakte flytter fuktig hengende mot prøven overflaten til hengende er fullstendig dekket av PBS buffer men fortsatt fra substrat overflate.Merk: For å redusere den termiske drift under eksperimentet, la hele systemet satt i noen minutter før du starter force spektroskopi målinger. Nærmer overflaten og registrere flere makt-avstand kurver (≥ 500) på forskjellige steder av prøven overflaten, med en kontakt styrke på 250 pN, en kontakt tid 1 s, en tilbakekallelse lengde på 2 µm og en tilbakekallelse hastighet på 1 µm s-1.Merk: For de generelle kraft spektroskopi justeringer, følg produsentens håndbok. Variasjoner: Retraksjon hastigheten kan varieres mellom 0,1 og 5 µm s-1 for å beregne kinetical data avhengig av økende styrke belastningen. Samhandling tiden kan varieres for å analysere tid avhengig bond styrke. I stedet for å holde retraksjon hastigheten konstant, kan man holde force konstant (force klemme modus). DataanalyseMerk: Dataanalyse ble utført ved hjelp av databehandlingen programvare. Avhengig av immobilisert proteiner kontakt tid eller retraksjon hastigheten, om en plass ble tatt eller ikke, andre variable parametere, inneholde kraft-avstand kurvene flere ulike opplysninger. Dataanalyse og tolkning kan variere mellom forskjellige SMFS eksperimenter og kan derfor ikke bli beskrevet i detalj her. Som for samhandlingen mellom RrgA og Fn, kan følgende protokollen være et første skritt for analyse av SMFS data. Åpne målt makt kurven filene ved å velge ikonet Åpen Batch av tvinge skanne og behandle kraft-avstand kurvene som følger: Konvertere cantilever nedbøyning (V) til direkte proporsjonal force (F) ved å velge ikonet (Re) Kalibrer V-nedbøyning av justere følsomheten og vår konstant .Merk: Hvis cantilever kalibrering er utført før eksperimentet, verdiene lagres i kraft skanning filer og brukes automatisk under kalibrering av V-nedbøyning. Hvis kalibreringen er utført etter eksperimentet, bruker programvaren standardverdier, som kan endres til måleverdiene. Trekk grunnlinje retraksjon kanalen i en region av makt kurven langt fra overflaten for å angi null styrke nivået ved å velge ikonet Planlagte subtraksjon.Merk: I noen tilfeller tilbakekallingen kan ikke ha samme konstant force verdi og kurven kan vise en lineær tilt, som kan fjernes ved å velge forskyvning + Tilt. Definer punktet der spissen kommer i kontakt med prøven ved å velge ikonet Kontakt peker besluttsomhet . Konvertere høyde signalet til tips utvalg separasjon ved å velge ikonet Tips utvalg separasjon . I tillegg til trekke kontaktpunkt posisjon, trekker denne prosedyren hengende bøying for å beregne avstanden mellom substrat overflate og AFM-spissen.Merk: For å feste polymer elastisk modeller, som extensible orm-lignende-kjeden modellen og fastsettelse av samhandling lengder, tips utvalg separasjon, som er rettet for cantilever bøying, kreves. For å bestemme styrken laster rente fra skråningen av makt kurven og z-piezo hastigheten, bør uncorrected force kurvene brukes. Skjermen kraft-avstand spor for force topper på ruptur lengder ovenfor 70 nm (lengden på strukket PEG avstandsstykket)36 sortere ut uspesifikke interaksjoner og bruke extensible orm-lignende-kjeden modellen til de valgte toppene ved å velge den Passe en Polymer forsyningskjeden modellen ikonet og valgte utvidbar ormen som forsyningskjeden modellen. Toppene i retraksjon makt kurven vil være utstyrt med denne modellen og ruptur styrker og lengder hentes, sammen med elastisk parameterne for polymer. Vise data som histogrammer viser den kraft og lengde distribusjon. Bruk minst 100 unbinding hendelser for histogrammer.

Representative Results

Protokollen beskrevet her resultater i en kovalente immobilisering av proteiner via deres tilgjengelige primære aminer med tilfeldig orientering (figur 1). Figur 2 viser et AFM bilde av en silanized glassoverflate med (venstre) og uten (høyre) Fn immobilisert, registreres etter dehydrering prøvene under en svak strøm av nitrogen. Silane polymer laget viser bare liten overflate corrugations med en høyde av ca 2-5 nm (figur 2, høyre), mens på overflaten functionalized med Fn, ca 10 nm høy Fn molekyler er tilsynelatende (figur 2, venstre). I nærbilder, kan dimeric strukturen i Fn gjenkjennes. Fn molekylene synes å være kompakt med en høyde på 4-5 nm over PEG overflatebehandlingen og en lengde på ~ 120 nm (se innlegg). Undersøke samhandling styrker RrgA med Fn, som ble nylig beskrevet i detalj av vår gruppe13, var RrgA koblet til en silicon nitride AFM tips og menneskelige Fn til barometer substrate (figur 3a). Figur 3 viser representant tips eksempel separasjon kurver av samspillet av RrgA med Fn spilt inn på en trekke hastighet på 1 µm s-1. Brukte overflatekjemi førte til en lav bakgrunn interaksjon og godt formet enkelt (eller dobbel) samhandling hendelser (figur 3a), som var utstyrt med en utvidbar orm som kjeden (eWLC) modell (rød kurver). Plotting resultatene av passer (ruptur kraft og -lengde, se Figur 4) viser at etter overvinne uspesifisert overflaten interaksjoner mellom AFM tips og underlaget og strekke PEG linkers (> 70 nm), opptil ~ 19% av force kurver viste brudd hendelser med en gjennomsnittlig ruptur kraft for RrgA – Fn samspillet av ~ 52 pN på en tips utvalg avstander på ca 100 nm. I kontrast, en uanvendelig overflatekjemi (her utelatt slukker med Tris bufret saltvann figur 3b) vil hindre en klar vurdering av enkelt samhandling hendelser på grunn av uspesifikke interaksjoner, flere protein binding (spor 2 og 3) og/eller Kovalente koblingen av proteiner mellom eksempel overflaten og AFM cantilever spissen. Dette fører til høyt ruptur styrker (spor 1) muligens ledsaget av unfolding av protein (Fn) domener (spor 4 og 5). Figur 1: oversikt over overflatekjemi. Hydrolyse av ethoxy silane-PEG-carboxyl etterfølges av sin kondens på hydrert glassplaten og dannelse av siloxane krysskoblinger. Reaksjonen av EDC med carboxyl grupper gir en reaktiv o- acylisourea, en Amin-reaktive mellomliggende med en ekstremt kort halveringstid i vandig løsning (hydrolyse). Mellomliggende stabiliseres ved dannelsen av en NHS ester som gjennomgår nukleofil substitusjon for å danne en amid bånd med primære aminer endelig på proteiner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2: Immobilisering av fibronectin på et glass substrat via heterobifunctional ethoxy silane pinne carboxyl kopling agent. AFM bilder av functionalized glass overflater med (venstre) og uten (høyre) Fn. tallene Fn molekyler, som distribueres homogent på underlaget overflaten (innlegg). Molekylene vedta en dimeric og kompakt struktur med en høyde på 4-5 nm over PINNEN belegg og en lengde på > 100 nm. Dette ligner strukturen i Fn i løsning og er i samsvar med tidligere AFM data på andre flater, f.eks glimmer (skala bar inlays = 500 nm)37. Under AFM er bilder høyde profiler langs linjene i AFM bildene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 3: bilde av en SMFS eksperiment og representant tvinge avstand kurver av RrgA – Fn samhandling. (a) RrgA og Fn ble covalently koblet via heterobifunctional ethoxy silane pinne carboxyl kopling agent til en silicon nitride AFM cantilever tips og en glassoverflate, henholdsvis. Representant SMFS tvinge avstand kurver hentes for RrgA – Fn interaksjon på en tilbakekallelse hastighet på 1 µm s-1 med den beskrevet immobilisering av RrgA og Fn vises. Rød kurver representerer den utvidbare orm som kjeden passer brukes for å få ruptur styrker og lengder. Figuren er endret fra Becke, et al., ACSnano 201813. (b) representant SMFS tvinge avstand kurver hentes for RrgA – Fn samhandling uten slukker med Tris bufret saltvann. I dette tilfellet primære Amin i Tris var fraværende slik at gjenværende aktive NHS estere var igjen umettede under eksperimentet. Dette førte til flere protein binding (spor 2 og 3) og fastklemming av proteiner mellom overflaten og AFM spissen som resulterte i høyt ruptur styrker ledsaget av (Fn-) domene unfolding (som spor 1, 4 og 5; Merk ulike skalaer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 4: Force og lengde distribusjon av én RrgA – Fn interaksjoner. Ruptur kraft og tilsvarende ruptur lengde histogrammer fra RrgA – Fn SMFS interaksjon målinger (n = 1400) på en tilbakekallelse hastighet på 1 µm s-1. Histogrammer avsløre en mest sannsynlig brudd force fMP av 51.6 pN (Gauss passe, svart linje) og en opphopning av brudd lengder rundt 100 nm. Figuren er endret fra Becke, et al., ACSnano, 201813. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Siden introduksjonen av AFM basert SMFS, det utviklet seg til en mye brukt teknikk å direkte undersøke intra- og intermolekylære kreftene personlige proteiner og nukleinsyrer andre biomolecules^3,4,5. For vellykket SMFS eksperimenter er en passende kobling strategi en forutsetning. For å undersøke intramolekylære kreftene i naturlige og syntetiske polymerer, kan polymerer være direkte koblet til substrat overflate og AFM tips^{36,38,39,40,41}. For etterforskningen av Inter molekylære interaksjoner, for eksempel molekylær bånd, men det er tilrådelig å bruke fleksible koblingsfunksjonalitet molekyler som hetero-bifunctional pinne linkers eller polypeptid kjeder, knytte samhandling partnerne til AFM spissen og substrat overflate, for å tillate riktig retning av bindende, å overvinne kort rekkevidde overflaten styrker og unngå rødsprit og utfolder proteiner^{21,22,23, 24,25,26,27,42}. Vi derfor beskrev en enkelt og likefrem protokoll for kovalente immobilisering av proteiner via deres tilgjengelige primære aminer bruke hetero-bifunctional pinne avstandsstykker.

Vi viste brukbarheten med etterforskningen av samspillet styrker mellom adhesin RrgA fra S. pneumoniae og ekstracellulær matrix protein Fn, som nylig beskrevet i detalj andre steder¹³.

Overflatekjemi er godt etablert og analysert og lignende tilnærminger har blitt brukt i flere SMFS eksperimenter^{19,42,43,44,45}. Silylether brukes til å koble den silane polymer til overflaten, er hydrolyse. Graden av hydrolyse avhenger av mengden dannet siloxane obligasjoner, hvilke kan kontrollert under silanization prosessen. Hvis høy interaksjon styrker (≥ 1000 pN) forventes i løpet SMFS mål, skal silanization utføres via damp-fase deponering³⁰ som resulterer i dannelsen av en kontinuerlig lag av siloxanes. Som for mange eksperimenter (f.eks, mange protein-protein interaksjoner) er samhandling styrkene i et par hundre pN, og beskrives fremgangsmåten som siloxane formasjon er utført av nedfall fra en vandige fasen og ubundet organo-silanes er nøye vaskes av med etanol (trinn 1.1.7) etterfulgt av herding med varme (trinn 1.1.8), er tilstrekkelig.

Et annet viktig skritt er å vaske resten EDC NHS molekyler av overflaten (trinn 1.2.3), som restene vil føre til aktivering av carboxyl grupper på proteiner. Dette kan enten føre crosslinking proteiner på samme overflaten, som kan endre funksjonaliteten eller covalently par aktivert proteiner til andre proteiner på det motsatte overflaten. Dette kan føre til fastklemming av proteiner mellom overflaten og AFM spissen, som resulterer i høyt ruptur styrker muligens ledsaget av domenet utspiller seg (se figur 3b, spor 1, 4 og 5, unfolding Fn domener)⁴⁶. Det samme problemet kan oppstå hvis de aktive NHS estere av PEG avstandsstykket er igjen umettet. Inkubasjon med Tris bufret saltvann anbefales derfor (trinn 1.2.6), som primære Amin i Tris slukker gjenværende amino reaktive gruppene.

Følger protokollen gradvis fører til en homogen fordeling av Fn på silanized glass overflaten (se figur 2), forlater en dimeric form av protein. Dette ligner Fn´s strukturen i løsning og er i samsvar med tidligere AFM data på andre prøve overflater³⁷. I tillegg er en passende konsentrasjonen av RrgA på AFM spissen oppnådd, som genererer en målverdi ~ 20% av veldefinerte samhandling hendelser i SMFS målinger (Figur 3 og Figur 4). En elegant måte å kontrollere mengden av molekyler kombinert til eksempel substrat og cantilever spissen Dessuten varierende protein konsentrasjon og/eller inkubasjon ganger, er en kombinasjon av silane-agenter med ulike sekundære funksjonsgruppene. Ved å endre forholdet mellom protein reaktive grupper fra PEG-polymer, kan antall immobilisert proteiner være kontrollert^15,16,17,18.

Protokollen beskrevet her kan også brukes til nakkens andre -NH₂ inneholder molekyler eller justeres par proteiner andre silisium oksid overflaten foruten glass og silicon nitride. Avhengig av protein design, gruppen Amin reaktive carboxyl kan endres til en sulfhydryl reaktive group (f.eks, maleimide eller Orto-pyridyl disulfide) å protein via dens ledig-SH grupper. For Fn resulterer dette i en forhåndsdefinert retning^13,17,20.

I sammendraget, denne protokollen kan justeres for å tjene ulike krav og er egnet for andre Biofysiske programmer foruten ett molekyl force spektroskopi eksperimenter.

Materials

Material
2-Propanol	Carl Roth	6752
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	03450	EDC
Acetic acid	Carl Roth	3738	100 %; analytical purity
Doubly distilled water
Ethanol	Carl Roth	9065	≥ 99.8 %; analytical purity
Ethoxy silane polyethylene glycol acid	Nanocs	PG2-CASL-5k	5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3
Hydrochloric acid	Carl Roth	X896	32 %
N-Hydroxysuccinimid	Merck	804518	NHS; for synthesis
Phosphate Buffered Saline – Dulbecco	Biochrom	L1825	PBS
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma	Sigma-Aldrich	F1056
Probe molecule e.g. RrgA			Produced in laboratory
Sodiumchlorid	Carl Roth	9265	NaCl
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Carl Roth	AE15	≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Beakers
Glass cutter
Glass slides	Carl Roth	0656
Inert gas desiccator	Sicco
Inverted Microscope – Zeiss Axiovert 200	Zeiss
JPK NanoWizard 1	JPK Instruments
JPK NanoWizard SPM and DP software	JPK Instruments
Laboratory oven	Binder
Magnetic stirrer	IKA
Micro spatula
Microcentrifuge tubes
Microsoft Excel	Microsoft
Parafilm M	Brand	701606
Petri dishes
pH-meter	Knick
Pipettes	Starlab		10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl
Precision balance	Acculab
Silicon nitride cantilever – MLCT	Bruker AXS S.A.S		Spring constant ≤ 100 pN/nm
Sonication bath	Bandelin
Staining jar
Stereo microscope – Zeiss Stemi	Zeiss
Stir bar
Kimtech science precision wipes	Kimberly-Clark
Twezzers
UV PenRay	UVP, LLC	90-0012-01	Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm
Vacuum desiccator
Vacuum pump
Vortex mixer	VWR
Weighing paper	Carl Roth	TP64