Denne protokol beskriver den kovalente immobilisering af proteiner med en heterobifunctional silan kobling agent til siliciumoxid overflader designet til atomic force mikroskopi baseret enkelt molekyle kraft spektroskopi som er eksemplificeret ved den samspillet mellem RrgA (pilus-1 spids adhesin af S. pneumoniae) med fibronektin.
I de seneste år baseret atomic force mikroskopi (AFM) enkelt molekyle kraft spektroskopi (SMF’ER) udvidet vores forståelse af molekylære egenskaber og funktioner. Det gav os mulighed for at udforske en mangfoldighed af biofysiske mekanismer, f.eks., hvordan bakteriel adhesins binde til vært overflade receptorer i flere detaljer. Blandt andre faktorer afhænger succesen med SMF’ER eksperimenter den funktionelle og indfødte immobilisering af biomolekyler af interesse på faste overflader og AFM tips. Her, beskriver vi en enkel protokol til kovalente kobling af proteiner til silicium overflader ved hjælp af silan-PIND-carboxyls og det veletablerede N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) kemi i rækkefølge at udforske samspillet mellem pilus-1 adhesin RrgA fra Gram-positive bakterien Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) med ekstracellulære matrix protein fibronektin (Fn). Vores resultater viser, at den overflade functionalization fører til en homogen fordeling af Fn på glasoverfladen og til en passende koncentration af RrgA AFM cantilever spids, tilsyneladende af målværdien på op til 20% af interaktion begivenheder under SMF’ER målinger og afslørede, at RrgA binder til Fn med en gennemsnitlig styrke på 52 pN. Protokollen kan justeres til par via specifikke gratis thiol webstedsgrupper. Dette resulterer i en foruddefineret protein eller molekyle orientering og er velegnet til andre biofysiske applikationer udover SMF’ER.
Ved siden af optiske og magnetiske pincet, atomic force mikroskop (AFM)1,2 er opstået som et nyttigt værktøj til at analysere og manipulere molekyler og sonde deres egenskaber og funktioner, herunder deres reaktion på ydre kraft3 ,4. I modsætning til metoder som enzym forbundet immunosorbent assay (ELISA), overflade plasmon resonans (SPR) eller kvarts krystal microbalance (QCM) opsætninger, AFM giver mulighed for at måle interaktioner på enkelt molekyle (SMF’ER)5 og enkelt celle niveau (SCFS)6 . Disse teknologier givet en værdifuld indsigt i bindende mekanismer som fange obligationer fundet for samspillet mellem E. coli pilus protein FimH med mannose7eller tandem β-lynlås gentager dannet af Fn-bindende proteiner fra S. aureus ved binding til Fn8. Vi har for nylig kunnet vise, at pilus-1 adhesin RrgA9,10 fra Gram-positive bakterien Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 er i stand til at binde til fibronektin12 med sine to terminal domæner. Dette afslørede en ny to-domæne bindende mekanisme, som adskiller sig fra tandem β-lynlås og kan aktivere piliated pneumokoktyper til at danne og vedligeholde en forbigående kontakt til fibronektin-holdige vært overflader13.
SMF’ER eksperimenter succes afhænger kritisk af funktionelle og indfødte immobilisering af biomolekyler på faste overflader og AFM tips. Som høje styrker kan forekomme under SMF’ER målinger, bør proteiner helst være kovalent koblet til overfladen. Der er et stort antal forskellige kobling metoder for immobilisering af proteiner og andre biomolekyler, samt hele celler på (uorganiske) faste overflader, nano-partikler og andre enheder, der er beskrevet i litteraturen14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Disse protokoller gør ofte brug af farlige stoffer, er vanskelige at udføre og/eller kræver særligt udstyr (f.eks., plasma renere). En enkel måde at par molekyler til glas er at vedhæfte en tykkere polymer lag af heterobifunctional overfladebehandlingsvæsker med en silan-reaktive gruppe på den ene side og en Amin-reaktive gruppe på deres anden side. Afhængigt af programmet, kobling agenter kan omfatte fleksible hydro-kulstof kæder af variabel længde, fx., polyethylenglycol (PEG). De undertrykker ikke specifikke vekselvirkninger mellem de modificerede overflader (f.eks., hydrofobe, elektrostatiske og van-der-Waals interaktioner) og kan give den koblede molekyle roterende frihed.
Her, vi beskriver en generel protokol til kovalente kobling af proteiner der indeholder en eller flere gratis amino grupper (-NH2) til glas overflader og silicon nitride AFM tips via en heterobifunctional ethoxy silan-PIND-carboxyl (-COOH). Denne protokol kan bruges i SMF’ER eksperimenter, som er eksemplificeret baseret på samspillet mellem RrgA og det ekstracellulære matrix protein Fn (Se figur 1 for en oversigt).
Det første skridt er silanisering af overflade28,29,30,31. Det drejer sig om hydrolyse af ethoxy grupper af kobling agent for at danne meget reaktive SiOH grupper. Disse kan reagere med SiOH grupper på underlaget. I en primær kondens skridt, disse silanols form brint obligationer og spredt på underlaget. I en sekundær kondensationsreaktion, (som normalt kræver varme eller vakuum for at fjerne vand), siloxan obligationer er dannet. Dette resulterer i en kovalent vedlagte organo-silan lag.
Det andet skridt er kobling af proteiner til den funktionelle (-COOH) grupper, som strækker sig fra polymer32. Først, syren er konverteret til en reaktiv N-hydroxysuccinimid (NHS) ester mellemliggende, som er opnået gennem den veletablerede NHS/EDC (1-ethyl – 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid kemi33 og gennemgår nukleofil substitution til sidst danne et AMID obligation med primære aminer på proteiner.
På denne måde RrgA var koblet til silicon nitride AFM tips og menneskelige Fn til glas substrater i en tilfældig retning og deres interaktion styrker blev analyseret på enkelt-molekyle niveau. Vores resultater viser, at den beskrevne overfladekemi fører en homogen fordeling af Fn på glasoverfladen og en passende koncentration af RrgA på spidsen, tilsyneladende af målværdien på op til 20% af interaktion begivenheder under SMF’ER målinger. Denne kemi reducerer uspecifikke baggrund interaktioner, er underlagt lille ændring under dataopsamling og egner sig derfor fortræffeligt til præcise SMF’ER eksperimenter.
Siden indførelsen af AFM baseret SMF’ER, det udviklede sig til en udbredt teknik til direkte sonde intra og intermolekylære kræfter af individuelle proteiner, nukleinsyrer og andre biomolekyler3,4,5. For vellykket SMF’ER eksperimenter er en passende overfladen kobling strategi en forudsætning. For at sonde intramolekylære kræfter i naturlige og syntetiske polymerer, kan polymerer være direkte koblet til substrat overflade og AFM tip36,38,39,40,41. Til undersøgelse af Inter molekylære interaktioner, såsom molekylære obligationer, men det er tilrådeligt at bruge fleksible linker molekyler såsom hetero-bifunctional PIND linkers eller polypeptidkæder, som fastgør interaktion partnere til AFM tip og den substrat overflade, for at muliggøre den korrekte orientering af de bindende partnere, at overvinde kortrækkende overflade kræfter og undgå denaturering og udfoldelsen af proteiner21,22,23, 24,25,26,27,42. Vi er derfor beskrevet en enkel og ligetil protokol for den kovalente immobilisering af proteiner via deres tilgængelige primære aminer ved hjælp af hetero-bifunctional PIND afstandsstykker.
Vi viste dens anvendelighed med undersøgelse af samspillet styrker mellem adhesin RrgA fra S. pneumoniae og ekstracellulære matrix protein Fn, som for nylig beskrevet i detaljer andetsteds13.
Den overfladekemi er veletableret og analyseret og lignende tilgange held har været anvendt i flere SMF’ER eksperimenter19,42,43,44,45. Silylether anvendes til kobling silan polymer til overfladen, er underlagt hydrolyse. Graden af hydrolyse afhænger af mængden af dannet siloxan obligationer, som kan kontrolleres under silanisering proces. Hvis høje interaktion styrker (≥ 1000 pN) forventes under SMF’ER målingerne, bør silanisering udføres via damp-fase deposition30 hvilket resulterer i dannelsen af et sammenhængende lag af hvis. Som for mange eksperimenter (fx, mange protein-protein interaktioner) er interaktion kræfter i rækken af et par hundrede pN, og proceduren beskrevet, i hvilken siloxan dannelse er udført af deposition fra en vandig fase og ubundne organo-silaner vaskes eftertænksomt med ethanol (trin 1.1.7) efterfulgt af hærdning med varme (trin 1.1.8), er tilstrækkelig.
En anden kritisk trin er at vaske den resterende EDC og NHS molekyler fra overfladen (trin 1.2.3), som rester vil føre til aktivering af carboxyl grupper på proteiner. Dette kan enten resultere i crosslinking af proteiner på den samme overflade, som kan ændre deres funktionalitet eller kovalent par aktiveret proteiner til andre proteiner på den modsatte overflade. Dette kan føre til fastspænding af proteiner mellem overfladen og AFM spids, hvilket resulterer i høje brud styrker eventuelt ledsaget af domæne udfoldning (Se figur 3b, spor 1, 4 og 5, udfoldelsen af Fn domæner)46. Det samme problem kan opstå, hvis de aktive NHS estere af PIND spacer umættede. Anbefales derfor, inkubation med Tris bufferet saltvand (trin 1.2.6), som den primære Amin af Tris slukker de resterende amino reaktive grupper.
Efter protokollen trinvis fører til en homogen fordeling af Fn på TOT silaniseret glas overflade (Se figur 2), forlader en dimerisk form af protein. Dette ligner Fn´s struktur i løsning og er i overensstemmelse med tidligere AFM data på andre prøve overflader37. Derudover opnås en passende koncentration af RrgA på AFM tip, som genererer en målværdi ~ 20% af veldefinerede interaktion begivenheder under SMF’ER målinger (figur 3 og figur 4). En anden elegant måde at kontrollere mængden af molekyler koblet til prøven substrat og cantilever tip udover varierende protein koncentration og/eller inkubation times, er kombinationen af silan-agenter med forskellige sekundære funktionelle grupper. Ved at ændre forholdet mellem protein reaktive grupper strækker sig fra PIND-polymer, kan antallet af immobiliserede proteiner være kontrolleret15,16,17,18.
Protokollen beskrevet her kan også bruges til at immobilisere andre -NH2 indeholder molekyler eller justeres til par proteiner til andre siliciumoxid overflade udover glas og silicon nitride. Afhængigt af protein designet, Amin reaktive carboxyl gruppe kan ændres til en sulfhydryl reaktive gruppe (f.eks.maleimide eller ortho-pyridyl disulfid) til par protein via dets frie-SH grupper. For Fn resulterer dette i en foruddefineret orientering13,17,20.
Sammenfattende denne protokol kan justeres for at tjene forskellige krav og er velegnet til andre biofysiske applikationer udover enkelt molekyle kraft spektroskopi eksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
TB og HG anerkende finansielle støtte gennem det Europæiske Forskningsråd “Cellufuel, avancerede Grant No. 294438”. HCS anerkender finansiel støtte fra Forbundsministeriet for uddannelse og forskning gennem Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt), SS anerkender finansiel støtte fra den bayerske stat Ministeriet for videnskab og uddannelse gennem forskningsfokus “Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe – galop”. Vi takker Conny Hasselberg-Christoph og Martina Hörig for teknisk support
Material | |||
2-Propanol | Carl Roth | 6752 | |
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | 03450 | EDC |
Acetic acid | Carl Roth | 3738 | 100 %; analytical purity |
Doubly distilled water | |||
Ethanol | Carl Roth | 9065 | ≥ 99.8 %; analytical purity |
Ethoxy silane polyethylene glycol acid | Nanocs | PG2-CASL-5k | 5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3 |
Hydrochloric acid | Carl Roth | X896 | 32 % |
N-Hydroxysuccinimid | Merck | 804518 | NHS; for synthesis |
Phosphate Buffered Saline – Dulbecco | Biochrom | L1825 | PBS |
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma | Sigma-Aldrich | F1056 | |
Probe molecule e.g. RrgA | Produced in laboratory | ||
Sodiumchlorid | Carl Roth | 9265 | NaCl |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Carl Roth | AE15 | ≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Beakers | |||
Glass cutter | |||
Glass slides | Carl Roth | 0656 | |
Inert gas desiccator | Sicco | ||
Inverted Microscope – Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | ||
JPK NanoWizard 1 | JPK Instruments | ||
JPK NanoWizard SPM and DP software | JPK Instruments | ||
Laboratory oven | Binder | ||
Magnetic stirrer | IKA | ||
Micro spatula | |||
Microcentrifuge tubes | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
Parafilm M | Brand | 701606 | |
Petri dishes | |||
pH-meter | Knick | ||
Pipettes | Starlab | 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl | |
Precision balance | Acculab | ||
Silicon nitride cantilever – MLCT | Bruker AXS S.A.S | Spring constant ≤ 100 pN/nm | |
Sonication bath | Bandelin | ||
Staining jar | |||
Stereo microscope – Zeiss Stemi | Zeiss | ||
Stir bar | |||
Kimtech science precision wipes | Kimberly-Clark | ||
Twezzers | |||
UV PenRay | UVP, LLC | 90-0012-01 | Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm |
Vacuum desiccator | |||
Vacuum pump | |||
Vortex mixer | VWR | ||
Weighing paper | Carl Roth | TP64 |