Övergående heterologa uttryck av biosyntetiska enzymer i Nicotiana benthamiana blad kan vidarekoppla endogena leveranser av 2,3-oxidosqualene mot produktion av nya värdefulla triterpene produkter. Är häri beskrivs ett detaljerat protokoll för snabb (5 dagar) förberedande produktion av triterpenes och analoger utnyttja denna kraftfulla växt-baserade plattform.
Triterpenes är en av de största och mest strukturellt olika familjer av naturliga växtprodukter. Många triterpene derivat har visat sig ha medicinskt relevant biologisk aktivitet. Hittills dock har denna potential inte översättas till en uppsjö av triterpen-härledda läkemedel i kliniken. Detta är utan tvekan (åtminstone delvis) en följd av begränsade praktiska syntetiska tillgång till denna klass av förening, ett problem som kan kväva utforskandet av struktur-aktivitetssamband och utveckling av ledande kandidater av traditionella läkemedel kemi arbetsflöden. Trots sin enorma mångfald, triterpenes är alla härstammar från en enda linjära föregångare, 2,3-oxidosqualene. Övergående heterologa uttryck av biosyntetiska enzymer i N. benthamiana kan vidarekoppla endogena leveranser av 2,3-oxidosqualene mot produktion av nya värdefulla triterpen-produkter som inte naturligt produceras av denna värd. Agro-infiltration är ett effektivt och enkelt sätt att uppnå övergående uttryck i N. benthamiana. Processen omfattar infiltration av växtblad med en suspension av Agrobacterium tumefaciens bär den uttryck construct(s) av intresse. Samtidig infiltration av en ytterligare A. tumefaciens stam bär en uttryck konstruera kodning ett enzym som ökar föregångare utbudet avsevärt ökar avkastningen. Efter en period av fem dagar, kan infiltrerade leaf materialet skördas och bearbetas för att extrahera och isolera den resulterande triterpene produkt(er). Detta är en process som är linjärt och tillförlitligt skalbar och helt enkelt genom att öka antalet plantor som används i experimentet. Är häri beskrivs ett protokoll för snabb förberedande produktion av triterpenes utnyttja denna växt-baserade plattform. Protokollet använder tredjeparts enkelt replikerbar vakuum infiltration utrustning, som tillåter samtidiga infiltrationen av upp till fyra fabriker, aktivera batch-wise infiltration av hundratals växter i en kort tidsperiod.
Triterpenes är en av de största och mest strukturellt olika familjer av naturliga växtprodukter. Trots sin enorma mångfald tros alla triterpene naturliga produkter härledas från den samma linjära föregångare 2,3-oxidosqualene, en produkt av den mevalonate vägen i växter. Ringbildning av 2,3-oxidosqualene är initieras och styrs av en familj av enzymer som kallas oxidosqualene cyclases (OSCs). Detta ringbildning steg representerar den första nivån av diversifiering, med hundratals olika triterpene ställningar har rapporterats från naturen1. Dessa ställningar är mer diversifierad genom att skräddarsy enzymer inklusive, men inte begränsat till, cytokrom p450s (CYP450s)1,2. Sådana biosyntetiska vägar kan leda till enorma komplexitet, ibland resulterar i färdiga produkter som är knappt igenkännliga från den överordnade triterpen. Till exempel tros den komplexa strukturen av den potenta insektsdödande och antifeedant limonoid azadirachtin härröra från en tetracyclic triterpene av tirucallane typ3.
Många triterpen-derived naturliga produkter, även de med relativt oförändrad överordnade ställningar, har visat sig ha medicinskt relevant biologisk aktivitet4,5,6,7. Hittills dock har denna potential inte översättas till en uppsjö av triterpen-härledda läkemedel i kliniken. Detta är utan tvekan (åtminstone delvis) en följd av begränsade praktiska syntetiska tillgång till denna klass av förening, ett problem som kan kväva utforskandet av struktur-aktivitetssamband och utveckling av ledande kandidater av traditionella läkemedel kemi arbetsflöden.
Övergående uttryck för triterpene biosyntetiska enzymer från andra växtarter i N. benthamiana blad kan vidarekoppla endogena leveranser av 2,3-oxidosqualene mot produktion av nya värdefulla triterpene produkter (figur 1). Denna process kan användas att funktionellt karakterisera kandidat enzymer och rekonstruera den biosyntetiska vägar av viktigt naturligt metaboliter. Likaså kan den även utnyttjas i kombinatoriska biosyntetiska metoder att producera roman triterpene produkter, en strategi som kan resultera i bibliotek av strukturellt relaterade analoger, vilket gör att systematiskt utforskande av de struktur-aktivitetssamband biologiskt aktiva bly föreningar8,9.
Agroinfiltration är ett effektivt och enkelt sätt att uppnå övergående uttryck i N. benthamiana blad. Processen omfattar infiltrationen av bladen med en suspension av A. tumefaciens bär det binärt uttryck construct(s) av intresse. Detta uppnås via tillämpningen av trycket som tvingar av vätskan genom de stomata, tränger undan luften i intercellulära utrymmet, och ersätta den med A. tumefaciens fjädring. Bakterierna överföra de respektive T-DNAs till inre av växtcellerna, vilket resulterar i lokaliserade och övergående proteinuttryck i den infiltrerade bladvävnad.
Medan varje binärt vektor som är lämplig för generering av transgena växter får anställas för övergående uttryck, vi använder den Ögonböna mosaik Virus CPMV-derived Hypertranslational (HT) protein uttryck system10, 11. i detta system genen sevärdheter ligger flankerad av oöversatta regioner (UTR) från den CPMV RNA-2. Det 5′ UTR innehåller ändringar vilket resulterar i mycket höga halter av protein översättning med ingen tillit till virusreplikation12. Denna teknik har utvecklats till den Easy-och-Quick (pEAQ) binära vector-serien som innehåller sitespecifika rekombination kloning protokoll-kompatibel konstruktioner (pEAQ –HT– DEST)10,11. De flesta pEAQ vektorer också innehålla en tomat yvig stunt virus-derived P19 ljuddämpningssystemet suppressor genen13 inom T-DNA del av uttrycket kassett, som kringgår behovet att coinfiltrate en separat P19-carrying stam och ger mycket hög nivå proteinuttryck i mottagande växten cell10,11.
Användning av N. benthamiana som ett uttryck-värd har särskilda fördelar när du arbetar med växt biosyntetiska vägar. Cell arkitekturen stöder egensäkra lämpliga mRNA och proteinprocessningen och korrekt uppdelning, förutom besitter den nödvändiga Co-enzymer, reductases (för CYP450s) och metaboliska prekursorer. Kolkälla är fotosyntes; växter kan således helt enkelt odlas i bra kvalitet kompost, som kräver endast vatten, CO2 (från luften) och solljus som indata. Plattformen är också mycket praktiskt för samtidig uttryck av olika kombinationer av proteiner, eftersom detta kan uppnås facilely genom samtidig infiltrationen av olika stammar av A. tumefaciens, förneka behovet av att bygga stora multigene uttryck kassetter. Dessutom kan processen vara linjärt och tillförlitligt skalas helt enkelt genom att öka antalet plantor som används i experimentet.
Tidigare arbete i vårt laboratorium har visat nyttan av denna plattform för preparativ skala experiment. Detta inkluderade utarbetandet av romanen triterpenes för användning i bioaktivitetsanalyser och skala upp för att uppnå gram kvantiteter av isolerade produkt. Dessutom ansamling av heterogen triterpene produkter kan ökas flera vik av samtidig uttryck av en N-terminal-stympad, feedback-okänsliga form av 3-hydroxi-, 3-methyglutary-coenzym en reduktas (tHMGR), en anslutningshastighet uppströms enzym i mevalonate väg8.
Nyckeln till sådana förberedande-skala experiment är förmågan att bekvämt upp-skala infiltration processen. I en typisk experiment, kan tiotals till hundratals växter behöva uppnå målet antalet isolerade produkt. Infiltrera enskilda blad för hand (med en onödigt spruta) är operativt krävande och ofta orimligt tidskrävande, vilket gör denna metod opraktiskt för rutinmässig skala upp. Vakuum infiltration erbjuder fördelar över hand infiltration, eftersom det inte är beroende av kunskapsnivån för operatören och tillåter infiltrationen av ett större område av blad yta. Denna procedur används kommersiellt för storskalig produktion av farmaceutiska proteiner14. Detta protokoll använder tredjeparts enkelt replikerbar vakuum infiltration utrustning, som kan konstrueras från kommersiellt tillgängliga delar. Detta tillåter samtidiga infiltrationen av upp till 4 växter, ger snabba och praktiska batch-wise infiltration av hundratals växter i en kort tidsperiod (figur 2a -2b). Vakuum infiltration apparaten består av en vakuumtorkugn som bildar infiltration kammare (figur 2f). Ugnen är kopplad till en pump via en vakuum reservoar. Detta minskar den tid som krävs för att uppnå önskad vakuum i infiltration kammare. Växter är säkrade i en skräddarsydd hållare och inverterad till en 10 L rostfritt stål vattenbad fylld med A. tumefaciens suspension (figur 2a -2 c). Fullständig nedsänkning av antennen delar av växterna är viktigt för effektiv infiltration. Vattenbadet sedan placeras inom infiltration kammare (figur 2d -2e), och det vakuum som tillämpas för att dra luften ur blad interstitiell utrymmen. När trycket har reducerats av 880 mbar (en process som tar ca 1 min) infiltration kammare förs snabbt tillbaka till atmosfärstryck 20-30 s genom att öppna ugnen inloppsventilen, varefter infiltration är klar.
Fem dagar efter infiltration är växtmaterial redo för skörd och efterföljande utvinning och isolering av de önska produkterna. Från denna punkt är processen helt enkelt en av naturlig produkt extraktion och rening från leaf material, ett arbetsflöde som är bekant för någon naturlig produkt kemist. Det finns15många olika metoder för inledande extraktion och efterföljande rening. Det lämpligaste valet av metoder och de exakta villkoren som används är starkt beroende av särskilda kemiska egenskaper hos sammansatta av intresse, förutom tillgången på kompetens eller utrustning. Det är inte möjligt att inkludera i detta protokoll en fullt generaliserbart, steg för steg metod för efterföljande bearbetning av skördade blad växtmaterial till isolerade produkt som kunde följas blint för någon triterpene produkt av intresse, inte heller skulle det vara lämpligt att försöka göra så. Dock kommer detta protokoll ger en översikt över grundläggande arbetsflödet används i vårt laboratorium och några metoder för att tidigt i processen, vilket enligt vår erfarenhet har visat sig vara generaliserbara för mest syresatt aglycone triterpene produkter. Detta inkluderar två relativt ovanligt tekniker, nämligen trycksatt lösningsmedel utvinning (PSE), och en bekväm heterogen fas metod för klorofyll borttagning med hjälp av ett starkt grundläggande jonbytare.
PSE är en mycket effektiv teknik för utvinning av små organiska molekyler från fasta matriser. Extraktioner utförs under tryck (ca. 100-200 bar), den största fördelen är förmågan att använda lindras temperaturer som överstiger den kokande peka av extraktionslösning. Detta kan avsevärt minska den tid och mängden spädningsvätska som krävs för att uppnå en uttömmande utvinning, jämfört med andra heta lösningsmedel tekniker såsom enkla refluxing eller Soxhlet extraktioner16. Kommersiella bänk PSE instrument finns tillgängliga, som använder utbytbara utvinning celler och automatiserade lösningsmedel hantering, värme och övervakning. Detta gör denna teknik mycket bekvämt. Det är också utan tvekan mindre farligt, särskilt för operatörer med begränsade praktiska kemi erfarenhet.
Förtvålning av råa blad extrakt med återloppskylare följt av vätska/vätska partitionering är en vanlig teknik för bulk avlägsnande av klorofyller före efterföljande rening eller analys. Men kan detta ofta vara operativt krävande i större skala. Detektering av gränssnitt eller produktförlust på grund av bildandet av emulsioner kan dessutom vara problematiskt. Användning av starkt grundläggande jonbytarmassor att utföra heterogen fas hydrolys kan fungera som ett praktiskt alternativ. Den pigmenterade delen av hydrolyserat klorofyll förblir klibbade till harts och helt enkelt kan avlägsnas genom filtrering. Detta protokoll använder tredjeparts en preparativ skala anpassning av en tidigare rapporterade analytiska procedur17 som sysselsätter en kommersiellt tillgänglig grundläggande-jonbytare.
Nedan beskriver vi ett snabbt och detaljerade protokoll för preparativ skala produktion av triterpenes utnyttja denna växt-baserade plattform. Detta protokoll används rutinmässigt i vårt laboratorium att förbereda tiotals till hundratals milligram av isolerade triterpene produkt för program sådan en strukturell karaktärisering av kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, eller vidare studier i funktionella analyser.
Kick-genom-satte vakuum infiltration tillåter detta protokoll att användas rutinmässigt i vårt laboratorium för preparativ produktion av triterpene föreningar av intresse för olika nedströms tillämpningar. Vakuum infiltration apparaten beskrivs här replikeras enkelt. Tillägg av vakuum reservoaren är tillrådligt att minska den tid som krävs för att dra nödvändiga dammsuga, men det är möjligt att helt enkelt återanvända en omodifierad vakuum ugn som infiltration kammare. Att skydda vakuumpumpen via tillägg av en lämplig kondensor är teoretiskt förnuftiga, men i vårt laboratorium har vi funnit att det är onödigt.
Infiltration täckning äventyras om bladen inte är helt nedsänkt i infiltration avstängning. Problemet minimeras genom att säkerställa att nivån av suspensionen når den övre ytan av innehavaren av växten, och att innehavaren av en växt är en tight passform för infiltration bad. Observera från figur 2 att den övre ytan av innehavaren av anläggningen är infälld i infiltration badet när på plats. Detta uppnås genom paneler på mellersta kanterna av innehavaren som bildar fästpunkten med toppen av infiltration badet. Infiltration suspensionen kräver periodiska tillägg att bibehålla suspension. Detta uppnås bäst genom tillsats av överskjutande infiltration suspension förhindra gradvis sänkning av OD600 under loppet av en stor batch-wise infiltration. Dock i våra händer verkar ersättning för vatten inte ha en märkbar effekt på förväntad avkastning i preparativ skala, även om detta har inte kvantitativt undersökt. Hur många växter kan infiltreras från en batch infiltration suspension är fortfarande en öppen fråga. Vi infiltrera rutinmässigt mellan 100 och 200 växter med ett parti av infiltration suspension. Dessutom är det normalt för vissa jord att läcka ut i infiltration suspensionen under loppet av infiltration processen. Detta har inte visat sig ha en märkbar effekt på infiltration effekt.
Under skörden är det tillrådligt (men inte kritiska) att skörda bara de blad som var infiltrerat (några blad kommer har vuxit efter infiltration). Selektiv skörd förhindrar utspädning med improduktiva vävnad, vilket annars skulle öka förhållandet mellan endogena orenheter i förhållande till sammansatta av intresse. Detta har en nominell effekt på användarvänlighet nedströms rening och ökar omfattningen av dessa processer. När du använder tHMGR för att öka föregångare leverans, är en necrosed fenotyp ofta observeras för att utveckla under tillväxtperioden efter infiltration. Detta är normalt och faktiskt stöd selektiv skörd och efterföljande torkningen. Det torkade blad pulvret kan vanligtvis lagras i en sluten behållare i en sval, torr, mörk plats, men helst i exsickator under vakuum. Detta beror på stabiliteten i sammansatta av intresserade. Var försiktig om du väljer att lagra i-80 ° C frys. Se till att de torkade bladen är i en vattentät behållare och vid utlagringen, tillåta denna behållare till rumstemperatur före öppning. Underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i rewetting av bladen, hindrar nedströms behandling.
Efter skörd stegen i detta protokoll tillhandahålls för illustrativa syften och stöd de forskare som kan ha begränsad praktisk kemi erfarenhet. De kan ersätta många andra naturprodukt utvinning/rening tekniker. Som beskrivs i inledningen, PSE har många fördelar, huvudstaden kostar emellertid av kommersiellt tillgängliga PSE apparater kan vara oöverkomliga och det är inte nödvändigt. Grundläggande jonbyte harts behandling är en mycket bekväm metod för att ersätta traditionella förtvålning följt av vätska/vätska partitionering. Det passar dock inte för produkter som innehåller karboxylsyra grupper eller funktionella grupper som skulle vara hydrolyseras under grundläggande villkor, såsom estrar. Dessa produkter skulle förväntas bibehållas på grundläggande jonbytaren. Dock finns det potential att utnyttja detta för en fånga och släpp förfarande (inte dokumenterats här). Där traditionella förtvålning vore lämpligt, fungerar grundläggande jonbyte harts behandling som ett bekvämt alternativ. Kromatografi metoden som beskrivs i steg 9, har befunnits vara generaliserbara för de föreningar som beskrivs i figur 3. Föreningar av ökad polaritet kan dock kräva en 100% etylacetat eluering längre. Med hänvisning till steg 9,2, nedströms fina rening är helt sammansatta specifika, och är också beroende på skala. Upprepade rundor av småskaliga flash kromatografi med optimerad lutningar, är oftast tillräcklig för att uppnå en renhet som är lämpliga för NMR analys. I större skala är kristallisering ofta ett praktiskt alternativ. I svåra fall, kan förberedande eller semi preparativ högpresterande vätskekromatografi (HPLC) användas beroende på önskad mängd isolerade förening. Exempel på nedströms reningsprocesser för ett antal representativa föreningar kan hittas någon annanstans8.
Det nuvarande protokollet, som presenteras här, används rutinmässigt i vårt laboratorium, och har visat nytta. Det finns dock fortfarande betydande utrymme för ytterligare optimering av uttryck-plattformen. Arbete pågår i vårt laboratorium för att undersöka hur ytterligare väg engineering och differentiell kontroll av protein uttryck nivåer kan förbättra triterpene produktionen ytterligare, medan medla toxicitet till värdceller. Det finns också potential att undersöka manipulation av intracellulära transport system20,21, och riktningen av enzymer till olika cellulära fack22,23, vägar som skulle kunna förbättra effektiviteten i flera oxidation händelser. Potentiella fördelar med att ändra underliggande morfologi av viktiga organeller kan också undersökas. Till exempel har överuttryck av domänen membran av Arabidopsis thaliana HMGR observerats för att inducera hypertrofi av endoplasmatiska retiklet i växter24; en viktig plats för CYP450-aktivitet. Detta protokoll är idealisk för produktion av milligram gram skala mängder triterpene produkter, och kan användas i forskning miljö åt föreningar för nedströms studie (t.ex. systematisk utforskandet av struktur-aktivitetssamband relationer och förundersökningar i farmakodynamiska och farmakokinetiska egenskaper blyföreningar av kliniska intresse). Men plattformen är linjärt och tillförlitligt skalbar helt enkelt genom att öka antalet plantor som används och praktiskhet i övergående uttryck via agroinfiltration har påvisats i industriell skala för framställning av farmaceutiska proteiner 14, finns det alltså potential för denna plattform för att förlängas för kommersiell produktion av högt värde triterpenes. Alternativt, det är också möjligt att föreställa sig produktion av stabila transformants transporterar den slutförda önskan multigene biosyntetiska väg, vilket gör att massa odling och fortsatt ‘jordbruk’ av transgena N. benthamiana stammar producerar olika föreningar kommersiellt värde.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick stöd av en Norwich forskning Park STUDENTTILLVARO (JR), beviljar den gemensamma Engineering och Physical Sciences Research rådet/Biotechnological och biologiska vetenskaper forskning rådet BBSRC-finansierade OpenPlant syntetisk biologi Research Centre (BB / L014130/1) (M.J.S., A.O.); en John Innes Centre kunskapsutbyte och kommersialisering bevilja (BB/KEC1740/1) (B.B.); BBSRC Institute strategiska programmet beviljande ‘Molekyler från naturen’ (BB/P012523/1) och stiftelsen John Innes (A.O.). Vi vill tacka George Lomonossoff för att tillhandahålla pEAQ vektorerna och Andrew Davis för fotografering.
GC-MS instrument | any | n/a | |
Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
Standing incubator | any | n/a | |
Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
Balance (2 figures) | any | n/a | |
Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
A -80 freezer | any | n/a | |
Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
Safety glasses | any | n/a | |
Lab coat | any | n/a | |
Autoclave | any | n/a | |
Consumables | |||
Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
Reagents | |||
Quartz sand, 0.3 – 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
Ethanol | VWR | 20821-330 | |
Milli-Q water | any | n/a | |
Levington F1 Compost | any | n/a | |
Levington F2 Compost | any | n/a | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
GATEWAY BP CLONASE ™ II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |