Summary

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

Published: September 01, 2018
doi:

Summary

Electroporation 셀에 관심사의 유전자를 전달 하는 효과적인 접근 이다. 적용 하 여이 접근에서 vivo에서 성인 마우스 지 루트 신경 절 (DRG)의 신경에, 축 삭 재생 비보를 공부 하는 모델을 설명 합니다.

Abstract

Electroporation 세포로 DNA 플라스 미드 또는 작은 RNA 분자를 소개 하는 필수적인 비 바이러스 성 유전자 transfection 접근 이다. 지 루트 신경 절 (Drg)에 감각 신경 두와 단일 축 삭을 확장합니다. 1 개 분 지가 주변 신경 (주변 지점), 그리고 다른 지점 입력 지 루트 (중앙 지점)를 통해 척수. 신경 손상 후 주변 지점 중앙 지점에 다시 생성 하지 않습니다 반면 견고 하 게 재생성 합니다. 높은 재생 능력으로 인해 감각 축 삭 재생 널리 사용 되었습니다 모델 시스템으로 서 말 초 신 경계 (PNS)에 중앙 신경 조직 (CNS) 포유류 축 삭 재생을 공부. 여기, 우리는 성숙한 감각 뉴런에서 vivo에서 electroporation 통해 유전자 발현 조작 하 이전 설립된 접근 프로토콜을 설명 합니다. Transfection 플라스 미드 또는 작은 RNA oligos (siRNAs 또는 microRNAs)을 바탕으로, 접근 방식 모두 손실 및 이득-의-기능 실험 연구 관심사의 유전자 또는 축 삭 재생 비보의 규제 microRNAs의 역할을 수 있습니다. 또한, 유전자 표현에 vivo에서 의 조작 제어할 수 있습니다 공간 및 일시적으로 비교적 짧은 시간 과정 내에서. 이 모델 시스템은 포유류 축 삭 재생 규제 vivo에분자 메커니즘을 조사 하는 독특한 도구를 제공 합니다.

Introduction

신경 외상으로 인 한 신 경계에서 부상 또는 다양 한 신경 퇴행 성 질환은 보통 모터, 감각 및 인지 기능에 결함에 결과. 최근, 많은 노력 복원 생리 functionsof 부상 신경1,2,3성인 신경 재생 효능 다시 설립에 헌신 하고있다. DRG에 감각 신경은 통증, 온도, 터치, 또는 몸 자세, 뇌 등 다른 감각 자극을 전달 하는 신경 세포의 클러스터. 이러한 뉴런의 각각 의사 유 니 폴라 이며 주변으로 확장 한 분기와 척수4향하고 다른 분기를 분기 하는 단일 축 삭을 포함 합니다. Drg의 성인 감각 신경 세포는 부상 후 적극적으로 그들의 축 삭을 재생성 하기 위해 알려진 몇 가지 성숙한 포유류 뉴런 중입니다. 따라서, 감각 축 삭의 상해는 광범위 하 게 고용 되었다 중요 한 모델로 axonal 재생 비보의 메커니즘을 연구.

Vivo에서 유전자 transfection 기법, 일반적으로 덜 설정 시간과 유전자 변형 동물을 사용 하 여 보다는 유전자의 기능을 공부 하 고 신 경계에 경로 신호에 필수적인 역할을 연주 하고있다. 주요 기술 두 가지 방법으로 분류 될 수 있다: 악기 및 바이러스 기반5. 성인 신경 세포에 유전자 배달 vivo에서 바이러스 성 기반 유전자 식6의 정확한 spatiotemporal 조작을 제공할 수 있습니다. 그러나, 노동 집약적인 프로세스는 바이러스-기반 방법, 생산 등 원하는 유전자를 포함 하는 바이러스 성 입자의 정화에서에서 포함 된다. 또한, 많은 바이러스 성 벡터 데이터 수집, 데이터 분석을 방해 하 고 실험 결과의 해석 가능성이 오해 수 있습니다 호스트의 면역 시스템을 활성화 수 있습니다. Electroporation, 일반적인 악기에 기초를 둔 transfection 접근 유전자 벡터 또는 세포7 외부 공간에서 작은 RNA oligos의 호의 정도, 세포와 핵 막의 침투성을 증가 하는 전기 펄스를 사용 하 여 . 생체 외에서 electroporation 널리 많은 세포 유형에 타겟된 유전자 발현을 조작 하기 위한 과도 하지만 매우 효율적인 전략으로 인식 된다. Vivo에서 electroporation만 일시적인 유전자 발현 바이러스 성 벡터에 비해 낮은 transfecting 효율 리드, 바이러스 접근 다양 한 장점이 있다. 예를 들어, 그것은 거의 모든 조직 및 세포7,,89에 적용할 수 있습니다. 또한, 특정 성적 증명서에 대 한 관심사의 유전자 또는 작은 RNA oligos (예: siRNAs, microRNAs) 인코딩 중 플라스 미드 대상 조직에 직접 주입 하 고 수 다음 전기적 펄스, 절차 하 게 하는 더 적은 노동-고 시간-소모입니다. 또한, 여러 개의 플라스 미드 및 단일 electroporation와 동시에 RNA oligos transfecting 가능 하다.

우리 성인 마우스 감각 신경 세포에 유전자 발현 조작 하 비보에 electroporation 접근 설립 및 성공적으로 적용 하 고 수많은 개척자 연구1,2,3 같은 접근 검증 ,8,10. 여기, 우리 포유류 축 삭 재생의 미래 연구를 위한이 방법의 사용을 촉진 하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시.

Protocol

모든 동물 실험 동물 프로토콜 존스 홉킨스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인에 따라 수행 했다. 1. 재료 및 시 약 동물 6 주 된 여성 CF1 쥐 실험에 대 한 30-35 g의 무게를 사용 합니다.참고: 쥐 그룹 보관 (5 쥐 감 금 소 당) 1/4″옥수수 옥수수 속 침구와 2″ 광장 nestlets 중첩에 대 한 개별적으로 통풍이 소독 장에 있었다. 감 금 소 제어 12 h 빛 …

Representative Results

세포 독성 transfection DRG electroporation vivo에서 의 속도가 높은 만큼, 우리 주입의 유효성을 검사 하 고 현재 프로토콜 및 electroporated 붙일 태그가 예측에 관한 siRNA L4 및 L5 Drg로 계량 하기. 분리 된 Drg cryo 단면화 및 immunohistochemistry (그림 1A-B)를 통해 처리 되었습니다. 주입 및 electroporation 후 세포 생존 율을 추정, L4와 L5에서 그대로 Drg ?…

Discussion

여러 수술 단계 특히 주의 필요합니다. L4 그리고 L5 Drg (somas의 위치), 좌 골 신경 지배, 올바르게 식별 하 고 유전자 구조와 주입을 해야 합니다. 그렇지 않으면, GFP 레이블링 됩니다 결 석 좌 골 신경 축 삭에. 장 골 볏 L4 및 L5 Drg를 정확 하 게 유용한 해부학 적 랜드마크로 서 볼 수 있습니다. 대부분의 마우스에 L5, L6 척추 사이 관절 면은 장 골 볏12인접. 또는, L3 DRG 선택할 수 있습?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

연구 추진 하는 사업 (F Q를 수 여. Z.) NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), 크레이그 H. Neilsen 재단 및 BrightFocus 재단.

Materials

ECM 830 Square wave electroporation system BTX Harvard Apparatus 45-0052 For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes BTX Harvard Apparatus 45-0524 For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III Parker Instrumentation 1096 Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller NARISHIGE PC-10
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments, Inc. 1902328
Stereo Dissection Microscope Leica M80
Microsurgery Rongeur F.S.T 16221-14
Microsurgery Forceps FST by DUMONT, Switzerland 11255-20 Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary World Precision Instruments, Inc. TW100-4 10 cm, standard wall
Tape Fisherbrand 15-901-30 For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402 Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 Sigma-Aldrich SIC003 Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 Dharmacon CP-004500-01-05 Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit Invitrogen Purelink K210016 GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye Millipore-Sigma F7252 For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine Putney, Inc NDC 26637-731-51 Anesthesia induction
Xylazine AnaSed NDC 59399-110-20 Anesthesia induction
Acetaminophen McNeil Consumer Healthcare NDC 50580-449-36 Post-surgical pain relief

Riferimenti

  1. Saijilafu, , et al. PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1. Nature Communications. 4, 2690 (2013).
  2. Zhang, B. Y., et al. Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).
  3. Jiang, J. J., et al. MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression. Cell Death & Disease. 6, 1865 (2015).
  4. Krames, E. S. The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain. Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).
  5. Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).
  6. Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions. Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).
  7. Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  8. Liu, C. M., et al. MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration. Genes & Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).
  9. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia dello sviluppo. 240 (1), 237-246 (2001).
  10. Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nature Communications. 2, 543 (2011).
  11. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859 (2016).
  12. Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique. Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).
  13. Dommisse, G. F. The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).
  14. Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice. Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).
check_url/it/58171?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Li, Q., Qian, C., Zhou, F. Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion. J. Vis. Exp. (139), e58171, doi:10.3791/58171 (2018).

View Video