התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון
Summary
אלקטרופורציה היא גישה יעילה כדי לספק את הגנים של אינטרסים לתוך תאים. על-ידי החלת גישה זה ויוו על הנוירונים של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון (DRG), נתאר מודל ללמוד האקסון התחדשות בתוך vivo.
Abstract
אלקטרופורציה היא גישה תרביות תאים ג’ין נגיפי חיוני כדי להציג את ה-DNA פלסמידים או מולקולות RNA קטנות לתוך התאים. נוירון חישה גנגליון העזוב שורש (DRGs) משתרע על אקסון אחד עם שני סניפים. סניף אחד הולך ההיקפית העצב (סניף היקפיים), ואת הסניף השני נכנס לחוט השדרה דרך השורש העזוב (סניף מרכזי). לאחר הפגיעה העצבית, הענף היקפיים מחדש robustly ואילו הסניף המרכזי לא להתחדש. בשל יכולת ההתחדשות גבוהה, התחדשות האקסון חושית כבר בשימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד התחדשות האקסון בתרבית של מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) והן על מערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שנוצרו קודם לכן הגישה לתמרן ביטוי גנים נוירונים סנסוריים בוגרים ויוו ויה אלקטרופורציה. בהתבסס על תקנים עם פלסמידים או oligos RNA קטנים (siRNAs או מיקרו Rna), הגישה מאפשר שני ניסויים הפסד, רווח-של-פונקציה ללמוד את התפקידים של גנים-של-אינטרסים או מיקרו Rna בוויסות של האקסון התחדשות בתוך vivo. בנוסף, המניפולציה של ג’ין ביטוי ויוו ניתן לשלוט במרחב והן חנותם בתוך מסלול זמן קצר יחסית. מערכת מודל זה מספק כלי ייחודי כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבו האקסון בתרבית של התחדשות הוא מוסדר ויוו.
Introduction
פגיעות במערכת העצבים שנגרם ע י פגיעה עצבית או מחלות ניווניות שונות בדרך כלל תוצאה של ליקויים-מוטורית, חושית ופונקציות קוגניטיביות. לאחרונה, מאמץ רב הוקדש העוצמה משובי הקמתה מחדש בנוירונים למבוגרים כדי לשחזר את functionsof פיזיולוגית נפגע נוירונים1,2,3. החישה הניריונים ב הרפובליקה הם מקבץ של תאי עצב מעבירים גירויים סנסוריים שונים, כגון כאב, טמפרטורה, מגע או תנוחת הגוף, אל המוח. כל אחד הנוירונים הללו מדומים unipolar ומכיל אקסון בודד זה bifurcates עם סניף אחד המתפרש הפריפריה, הסניף השני לכיוון חוט השדרה4. הנוירונים חושית למבוגרים ב- DRGs הם בין כמה נוירונים יונקים בוגרים ידוע להתחדש אקסונים שלהם באופן פעיל לאחר פציעה. לפיכך, פציעות של אקסונים סנסוריים יש כבר בהרחבה מועסקים כמודל מכריע ללמוד על מנגנוני התחדשות עצב בתוך vivo.
In vivo ג’ין תרביות תאים טכניקות, אשר בדרך כלל פחות זמן רב להגדיר וגמיש יותר מאשר באמצעות בעלי חיים מהונדס, יש משחק תפקידים חיוניים לומד את הפונקציות של גנים, איתות המסלולים במערכת העצבים. ניתן לסווג את הטכניקות העיקריות שתי גישות: מבוסס על כלי נגינה, מבוסס על וירוס5. מבוסס-ויראלי ויוו המסירה הגן בנוירונים למבוגרים יכולים לספק מדויק ייתכן מניפולציה של ביטוי גנים6. עם זאת, תהליכים עתירי עבודה מעורבים שיטות מבוססות-ויראלי, כגון ייצור, טיהור של נגיפים המכילים את הגן הרצוי. בנוסף, רבים וקטורים ויראלי יכול להפעיל את מערכת החיסון של הפונדקאי, אשר עשויים להפריע רכישת נתונים, ניתוח נתונים, יכול להטעות את הפרשנות של תוצאות הניסוי. אלקטרופורציה, בגישה תקנים המבוסס על כלי טיפוסי, משתמשת פולס חשמלי כדי להגדיל את החדירות של התא וממברנות גרעיני transiently, אשר מעדיף זרם של וקטורים ג’ין או oligos RNA קטנים מהחלל מחוץ לתאים7 . אלקטרופורציה במבחנה מוכר באופן נרחב אסטרטגיה ארעי אך יעיל ביותר לטיפול ממוקד גנים סוגי תאים רבים. למרות ויוו אלקטרופורציה מוביל רק ביטוי גנים ארעית עם יעילות transfecting נמוך לעומת וקטורים ויראלי, יש לו יתרונות שונים על גישות ויראלי. לדוגמה, ניתן להחיל אותה כמעט כל רקמות ותאים7,8,9. בנוסף, גם פלסמידים קידוד oligos RNA גנים-של-ריבית או קטן (למשל, siRNAs, מיקרו Rna) נגד תעתיקים מסוימים יכול להיות מוזרק ישירות רקמת המטרה, ואז חשמלית פעמו, אשר להפוך את ההליך העבודה פחות – ו זמן – רב. יתר על כן, transfecting פלסמידים מרובים, RNA oligos בו זמנית עם אלקטרופורציה יחיד אפשרי.
יש נוסדה גישה אלקטרופורציה ויוו לתמרן ביטוי גנים ב העכבר למבוגרים החישה הניריונים, הוחלו בהצלחה ואנו לאימות גישה כזו אינספור מחקרים חלוצים1,2,3 8, ,10. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי להקל על השימוש בגישה זו עבור מחקרים עתידיים של האקסון בתרבית של התחדשות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר פעולות כירורגיות דורשים תשומת לב מיוחדת. L4 ו- L5 DRGs (מיקום של somas), אשר שולטים בעצב, צריך להיות מזוהה כראוי ו מוזרק עם ג’ין בונה. אחרת, תיוג-GFP תהיה חסרה ב אקסונים בעצב. ניתן להציג את crests iliac בתור ציוני דרך אנטומיות שימושיות לאתר L4 ו- L5 DRGs. במרבית העכברים, היבט משותף בין חוליות L5 ו L6 היא תכתיר ilia…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר מומן (מוענק F-Q. צ) NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), קרן Neilsen ה. קרייג ושל קרן BrightFocus.
Materials
| ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
| Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
| Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
| Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
| Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
| Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
| Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
| Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
| 2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
| siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
| microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
| Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
| Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
| Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
| Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
| Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |
Riferimenti
- Saijilafu, , et al. PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1. Nature Communications. 4, 2690 (2013).
- Zhang, B. Y., et al. Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).
- Jiang, J. J., et al. MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression. Cell Death & Disease. 6, 1865 (2015).
- Krames, E. S. The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain. Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).
- Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).
- Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions. Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).
- Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Liu, C. M., et al. MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration. Genes & Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia dello sviluppo. 240 (1), 237-246 (2001).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nature Communications. 2, 543 (2011).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859 (2016).
- Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique. Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).
- Dommisse, G. F. The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).
- Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice. Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).
