Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto
Summary
Eletroporação é uma abordagem eficaz para entregar genes de interesse em células. Aplicando-se esta abordagem na vivo sobre os neurônios do gânglio de raiz dorsal do rato adulto (DRG), descrevemos um modelo para estudo de regeneração do axônio em vivo.
Abstract
Eletroporação é uma abordagem de transfecção do gene não-virais essenciais para introduzir DNA plasmídeos ou pequenas moléculas de RNA em células. Um neurônio sensorial no gânglio da raiz dorsal (DRGs) estende-se a um único axônio com dois ramos. Um ramo vai para o periférico nervo (ramo periférico) e o outro ramo entra a medula espinhal através da raiz dorsal (agência central). Após a lesão neural, o ramo periférico regenera robustamente Considerando que a agência central não se regenera. Devido a alta capacidade regenerativa, regeneração do axônio sensorial foi amplamente utilizada como um sistema modelo para estudar a regeneração do axônio mamíferos no sistema nervoso periférico (SNP) e sistema nervoso central (SNC). Aqui, descrevemos um protocolo de abordagem estabelecida anteriormente para manipular a expressão gênica em neurônios sensoriais maduros na vivo via eletroporação. Baseado na transfecção com plasmídeos ou pequeno RNA oligos (siRNAs ou microRNAs), a abordagem permite ambas as experiências de perda e ganho-de-função estudar os papéis de genes de interesse ou microRNAs no Regulamento do axônio regeneração em vivo. Além disso, a manipulação do gene expressão na vivo pode ser controlada tanto espacial e temporalmente dentro de um curso de tempo relativamente curto. Este modelo sistema fornece uma única ferramenta para investigar o mecanismo molecular pelo qual a regeneração do axônio mamíferos é regulamentado na vivo.
Introduction
Lesões no sistema nervoso causaram por trauma neural ou várias doenças neurodegenerativas geralmente resultam em defeitos nas funções motoras, sensoriais e cognitivas. Recentemente, muito esforço tem sido dedicado para restabelecimento de potência regenerativa nos neurônios adultos para restaurar o functionsof fisiológicas ferido neurônios1,2,3. Neurônios sensoriais em DRG são um aglomerado de células nervosas que transmitem diferentes estímulos sensoriais, tais como dor, temperatura, toque ou postura do corpo, para o cérebro. Cada um desses neurônios é pseudo unipolar e contém um único axônio que se bifurca com um ramo, estendendo-se em direção a periferia e o outro ramo indo em direção a medula espinhal4. Os neurônios sensoriais adultos DRGs estão entre alguns neurônios de mamíferos maduros conhecidos para regenerar seus axônios ativamente após lesão. Daí, lesões de axônios sensoriais têm sido empregadas extensivamente como um modelo fundamental para estudar os mecanismos de regeneração axonal em vivo.
Na vivo técnicas transfeccao de gene, que são geralmente menos demorado para configurar e mais flexível do que usando animais transgénicos, jogar papéis essenciais em estudar as funções dos genes e sinalização de caminhos no sistema nervoso. As principais técnicas podem ser classificadas em duas abordagens: instrumento-vírus baseados e5. Viral-baseado na vivo entrega gene nos neurônios adultos pode fornecer precisa spatiotemporal manipulação do gene expressão6. No entanto, processos de trabalho intensivos estão envolvidos em métodos baseados em viral, tais como a produção e purificação de partículas virais, contendo o gene desejado. Além disso, muitos vetores virais poderiam ativar o sistema imunológico do hospedeiro, que pode interferir com a aquisição de dados, análise de dados e possivelmente induzir em erro a interpretação dos resultados experimentais. Eletroporação, uma abordagem típica do transfection baseado no instrumento, utiliza um pulso elétrico para aumentar a permeabilidade da célula e as membranas nucleares, transitoriamente, o que favorece o afluxo de vetores de gene ou pequeno RNA oligos do espaço fora das células7 . Em vitro eletroporação é amplamente reconhecida como uma estratégia transitória, mas altamente eficiente para manipular a expressão de genes alvo em muitos tipos de células. Embora na vivo electroporation leva apenas a expressão do gene transiente com baixa eficiência transfecting comparada com vetores virais, tem várias vantagens sobre abordagens virais. Por exemplo, pode ser aplicado a quase todos os tecidos e células de7,8,9. Além disso, qualquer codificação de genes de interesse ou pequenos oligos RNA (por exemplo, siRNAs, microRNAs) contra certas transcrições de plasmídeos podem ser injetados diretamente no tecido alvo e então eletricamente pulsados, que tornar o processo menos trabalho – e tempo – consumindo. Além disso, transfecting múltiplos plasmídeos e RNA oligos simultaneamente com eletroporação único é possível.
Nós temos estabelecido uma abordagem electroporation in vivo , para manipular a expressão gênica em neurônios sensoriais do rato adulto e aplicado com sucesso e validado tal abordagem em numerosos estudos pioneiros1,2,3 ,8,10. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para facilitar o uso desta abordagem para futuros estudos de regeneração do axônio dos mamíferos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Várias etapas cirúrgicas requerem especial atenção. A L4 e L5 DRGs (localização de somas), que dominam o nervo ciático, precisam ser corretamente identificado e injetado com construções de gene. Caso contrário, o GFP-rotulagem estarão ausente em axônios do nervo ciático. As cristas ilíacas podem ser vistas como útil pontos anatômicos para localizar a L4 e L5 DRGs. Na maioria dos ratos, o aspecto comum entre as vértebras L5 e L6 é próxima de cristas ilíacas12. Alternativamente, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi financiado (concedido a F-Q. Z) pelo NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), a Fundação de Neilsen H. Craig e a Fundação de BrightFocus.
Materials
| ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
| Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
| Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
| Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
| Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
| Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
| Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
| Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
| 2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
| siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
| microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
| Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
| Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
| Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
| Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
| Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |
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