रोगी-व्युत्पंन ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के 3-आयामी संस्कृति के लिए Hyaluronic-एसिड आधारित Hydrogels
Summary
यहां, हम रोगी के तीन आयामी संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान orthogonally स्वरित्र के भीतर ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं व्युत्पंन मस्तिष्क मैट्रिक्स की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया माल । इस दृष्टिकोण में एक इन विट्रो, प्रयोगात्मक मंच है कि vivo ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं में आम तौर पर संस्कृति में खो के कई विशेषताओं का कहना है प्रदान करता है ।
Abstract
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) सबसे आम है, अभी तक सबसे घातक, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र कैंसर । हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों पर ध्यान केंद्रित किया है कि कैसे extracellular मैट्रिक्स (ECM) अद्वितीय मस्तिष्क पर्यावरण की, जैसे hyaluronic एसिड (HA), जीबीएम प्रगति और आक्रमण की सुविधा. हालांकि, इन विट्रो संस्कृति मॉडल में सबसे जीबीएम कोशिकाओं के बाहर एक ECM के संदर्भ में शामिल हैं । जीबीएम कोशिकाओं के Murine xenografts आमतौर पर के रूप में अच्छी तरह से उपयोग किया जाता है । हालांकि, vivo मॉडल में यह मुश्किल ट्यूमर व्यवहार करने के लिए जटिल ट्यूमर microenvironment की व्यक्तिगत सुविधाओं के योगदान को अलग करने के लिए बनाते हैं । यहां, हम एक हा hydrogel-आधारित, तीन आयामी (3 डी) संस्कृति मंच है कि शोधकर्ताओं को स्वतंत्र रूप से हा एकाग्रता और कठोरता को बदलने के लिए अनुमति देता है का वर्णन । उच्च आणविक भार हा और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) शामिल hydrogels, जो रहते कोशिकाओं की उपस्थिति में माइकल प्रकार के अलावा crosslinked हैं । रोगी की 3 डी hydrogel संस्कृतियों-व्युत्पंन जीबीएम कोशिकाओं के रूप में अच्छी के रूप में व्यवहार्यता और प्रसार दर प्रदर्शन, या से बेहतर है, जब मानक gliomaspheres के रूप में संस्कृति । hydrogel प्रणाली भी ECM-mimetic पेप्टाइड्स के शामिल करने के लिए विशिष्ट सेल ECM बातचीत के प्रभाव को अलग करने के लिए सक्षम बनाता है । Hydrogels ऑप्टिकली पारदर्शी ताकि जीवित कोशिकाओं 3 डी संस्कृति में imaged किया जा सकता है । अंत में, हा hydrogel संस्कृतियों आणविक और सेलुलर विश्लेषण के लिए मानक तकनीकों के साथ संगत कर रहे हैं, पीसीआर सहित, पश्चिमी सोख्ता और cryosectioning इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा पीछा किया ।
Introduction
तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों दोहराऊंगा कोशिकाओं और उनके आसपास के extracellular मैट्रिक्स (ECM) के बीच बातचीत देशी ऊतकों में बेहतर उनके दो आयामी (2d) समकक्षों1,2से । ऊतक इंजीनियरिंग में प्रगति परिष्कृत, 3 डी संस्कृति प्लेटफार्मों कि 1 में नियंत्रित जांच सक्षम) कैसे रासायनिक और मैट्रिक्स microenvironment के भौतिक घटकों को प्रभावित सेल व्यवहार और 2) नई चिकित्सीय की प्रभावकारिता उपज है 2कैंसर सहित रोगों की एक संख्या के लिए रणनीतियों, । इन विट्रो मॉडल में इस तरह के अंत: स्रावी और प्रतिरक्षा संकेतों के रूप में प्रणालीगत कारकों, के लिए खाते में नहीं कर सकते, और इस तरह vivo मॉडल में पूरी तरह से प्रतिस्थापित नहीं कर सकता, वे reproducibility सहित कई लाभ प्रदान, प्रयोगात्मक नियंत्रण, सामर्थ्य और गति । यहाँ, हम मस्तिष्क के उपयोग का वर्णन-mimetic hydrogels जिसमें रोगी की 3 डी संस्कृतियों-व्युत्पन्न मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं ट्यूमर शरीर विज्ञान के कई पहलुओं पर कब्जा, विशेष रूप से, उपचार प्रतिरोध प्राप्त करने की गतिशीलता3. इन विट्रो तरीकों में अन्य की तुलना में, इन संस्कृतियों बेहतर vivo ट्यूमर मॉडल और नैदानिक टिप्पणियों में प्रतिनिधित्व3.
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) सबसे अक्सर और घातक मस्तिष्क में उद्भव कैंसर है, केवल 1-2 साल4,5का एक औसत अस्तित्व के साथ । हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों जीबीएम6,7,8में ट्यूमर मैट्रिक्स पर्यावरण के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित किया है । अद्वितीय मस्तिष्क ECM जीबीएम सेल प्रवास, प्रसार, और चिकित्सीय प्रतिरोध6,7,8,9,10,11 प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है , 12. Hyaluronic एसिड (हा) मस्तिष्क में एक प्रचुर मात्रा में glycosaminoglycan (झूठ) है, जहां यह अंय परिहास और proteoglycans के साथ बातचीत के लिए एक hydrogel की तरह जाल13फार्म । कई अध्ययनों से बताया है जीबीएम ट्यूमर में हा एक्सप्रेस और इसके बाद कैंसर प्रगति पर प्रभाव8,9,13,14,15,16 ,17. अन्य ECM घटक भी जीबीएम ट्यूमर वृद्धि और आक्रमण6,7,15,18को प्रभावित करते हैं । उदाहरण के लिए, fibronectin और vitronectin, जो आम तौर पर जीबीएम में व्यक्त कर रहे हैं, heterodimerization सेल की सतह integrin रिसेप्टर्स के “RGD” अनुक्रम के लिए बाध्यकारी के माध्यम से प्रेरित और ट्यूमर अस्तित्व को बढ़ावा देने कि जटिल संकेतन कैस्केडिंग आरंभ19 ,20,21. इसके अलावा जैव रासायनिक प्रभाव, ऊतक मैट्रिक्स के भौतिक गुणों को भी प्रभावित जीबीएम प्रगति22,23.
उपचार के लिए प्रतिरोध के नित्य अधिग्रहण जीबीएम घातकता4के मुख्य ड्राइवरों में से एक है । 2d या gliomasphere मॉडल में आशाजनक परिणाम दिखा ड्रग्स बाद में पशु अध्ययन और नैदानिक मामलों3में विफल रहे हैं, यह दर्शाता है कि microenvironmental कारकों के प्रभाव काफी जीबीएम ट्यूमर प्रतिक्रिया1में योगदान दिया । जबकि पशु मॉडल एक 3 डी प्रदान कर सकते हैं, शारीरिक रूप से उपयुक्त microenvironment रोगी कोशिकाओं xenografted और नैदानिक प्रासंगिक परिणाम उत्पंन24,25, vivo में मस्तिष्क microenvironment की जटिलता यह निर्धारित करने के लिए जो सुविधाओं, सेल मैट्रिक्स बातचीत सहित, विशिष्ट जैविक परिणामों के लिए महत्वपूर्ण है चुनौतीपूर्ण बनाता है । नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान से सरलीकृत संस्कृति प्लेटफार्मों के उपयोग में लाभ होगा जिसमें जैव रासायनिक और भौतिक गुणों को परिभाषित किया गया है ।
विपरीत पहले जीबीएम ट्यूमर microenvironment26,27 जो ECM के व्यक्तिगत जैव रासायनिक और भौतिक सुविधाओं पर सच ओर्थोगोनल नियंत्रण हासिल नहीं किया है के जैव सामग्री मॉडल की रिपोर्ट यहां रिपोर्ट जीबीएम सेल phenotype के लिए कई स्वतंत्र सुविधाओं के योगदान के युग्मन सक्षम बनाता है । यहां, हम रोगी-व्युत्पंन जीबीएम कोशिकाओं की 3 डी संस्कृति के लिए एक हा आधारित, orthogonally स्वरित्र, hydrogel प्रणाली प्रस्तुत करते हैं । Hydrogels दो बहुलक घटकों से बनते हैं: 1) जैविक रूप से सक्रिय हा और 2) जैविक रूप से निष्क्रिय पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) । खूंटी एक व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है और कम प्रोटीन सोखना और ंयूनतम immunogenicity28के साथ संगत हाइड्रोफिलिक सामग्री । यहां, ग्लुकुरोनिक एसिड moieties का हा जंजीरों पर लगभग 5% thiol समूहों के साथ कार्यात्मक के लिए crosslinking सक्षम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4 हाथ-खूंटी माइकल के माध्यम से maleimides-प्रकार के अलावा समाप्त कर रहे हैं । शरीर में अपने सबसे आम रूप में, हा उच्च आणविक वजन (HMW) जंजीरों में मौजूद है । यहां, HMW हा के संशोधन के एक कम डिग्री (500-750 केडीए) CD4429सहित हा और उसके सेल रिसेप्टर्स की देशी बातचीत को बनाए रखने में मदद करता है. maleimides के लिए कुल thiols के एक निरंतर दाढ़ अनुपात को बनाए रखते हुए हा-thiol के लिए खूंटी-thiol प्रतिस्थापन करके, हा एकाग्रता परिणामस्वरूप hydrogels के यांत्रिक गुणों से जोड़ा जा सकता है । इसके अलावा, stoichiometric नियंत्रण प्रत्येक 4 हाथ-खूंटी पर maleimide-समाप्त हथियारों की एक निर्धारित औसत संख्या के लिए cysteine समाप्त पेप्टाइड्स संयुग्मी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ECM के शामिल-व्युत्पंन, चिपकने वाला पेप्टाइड्स integrins के साथ प्रसंस्कृत कोशिकाओं पर बातचीत में सक्षम बनाता है, जिसके माध्यम से जैव रासायनिक और रासायनिक संकेतों1transduced हैं । Maleimide-thiol इसके अलावा बहुत जल्दी शारीरिक स्थितियों के तहत होता है, कोशिका encapsulation के लिए आवश्यक समय को कम करने और रोगी व्युत्पंन कोशिकाओं का अधिकतम अस्तित्व । इसके अलावा, hydrogel संस्कृतियों ठेठ ऊतक नमूना की तरह व्यवहार किया जा सकता है और पश्चिमी सोख्ता, प्रवाह cytometry, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला सहित मानक लक्षण वर्णन तकनीक के साथ संगत कर रहे हैं । निंनलिखित प्रोटोकॉल hydrogels निर्माण के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन, रोगी की 3 डी संस्कृतियों-व्युत्पंन जीबीएम कोशिकाओं और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए तकनीकों की स्थापना ।
Protocol
Representative Results
Discussion
reproducible इस 3 डी संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर डेटा की जनरेशन की आवश्यकता है: 1) अनुरूप बैच-to-बैच thiolation of HA, 2) अभ्यास के कुशल मिश्रण प्राप्त करने के लिए hydrogel पुरोगामी और हैंडलिंग hydrogel संस्कृतियों के नुकसान को रोकने के …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के NIH (R21NS093199) और UCLA आर्क 3R’s पुरस्कार से धन के साथ समर्थन किया गया था । हमारे sincerest धंयवाद HK301 और HK157 सेल लाइनों के प्रावधान के लिए डॉ हार्ले Kornblum की प्रयोगशाला में जाओ । हम भी ucla ऊतक पैथोलॉजी कोर प्रयोगशाला (TPCL) cryosectioning के लिए धंयवाद, उंनत प्रकाश माइक्रोस्कोपी/स्पेक्ट्रोस्कोपी कोर सुविधा (कैलिफोर्निया Nanosystems संस्थान में भिक्षा) (CNSI) के लिए ucla में फोकल माइक्रोस्कोप, ucla Crump संस्थान के उपयोग के लिए IVIS इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करने के लिए आण्विक इमेजिंग, ucla आणविक उपकरण केंद्र (MIC) चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदान करने के लिए, और प्रवाह Cytometry कोर में Jonsson व्यापक कैंसर केंद्र (JCCC) UCLA में प्रवाह के लिए उपकरण प्रदान करने के लिए cytometry ।
Materials
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
Riferimenti
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