Acido ialuronico base di idrogel per cultura 3-dimensionale delle cellule di Glioblastoma paziente-derivato
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la cultura tridimensionale delle cellule di glioblastoma paziente-derivato all’interno di biomateriali ortogonalmente sintonizzabile progettate per imitare la matrice di cervello. Questo approccio fornisce un in vitro, una piattaforma sperimentale che mantiene molte caratteristiche in vivo delle cellule di glioblastoma in genere perdite nella cultura.
Abstract
Glioblastoma (GBM) è il più comune, ancora più letale, il cancro del sistema nervoso centrale. Negli ultimi anni, molti studi si sono concentrati su come la matrice extracellulare (ECM) dell’ambiente unico cervello, come l’acido ialuronico (HA), facilita l’invasione e la progressione di GBM. Tuttavia, la maggior parte dei modelli in vitro cultura includono cellule di GBM all’esterno del contesto di un ECM. Murini xenotrapianti di cellule di GBM sono utilizzati comunemente come pure. Tuttavia, in vivo modelli rendono difficile isolare i contributi delle singole caratteristiche del microambiente tumorale complesso comportamento del tumore. Qui, descriviamo una piattaforma di base di idrogel, tridimensionale (3D) cultura HA che permette ai ricercatori di alterare in modo indipendente rigidità e concentrazione dell’HA. Ad alto peso molecolare HA e polietilenglicole (PEG) comprendono gli idrogel, che sono reticolate tramite aggiunta di Michael-tipo in presenza di cellule vive. Idrogel 3D culture della paziente-derivato GBM cellule Mostra vitalità e proliferazione prezzi buono come o meglio di, quando coltivate come standard gliomaspheres. Il sistema di idrogel permette inoltre di incorporazione di peptidi ECM-mimetici per isolare gli effetti delle interazioni cellula-ECM specifici. Idrogeli sono otticamente trasparenti in modo che le cellule vive possono essere imaged in 3D cultura. Infine, HA idrogel culture sono compatibili con le tecniche standard per analisi molecolari e cellulari, tra cui PCR, Western blotting e cryosectioning seguita da immunofluorescenza.
Introduction
Sistemi tridimensionali (3D) cultura ricapitolano le interazioni tra cellule e loro circostante matrice extracellulare (ECM) nei tessuti nativi meglio di loro bidimensionale (2D) controparti1,2. Avanzamenti nell’ingegnerizzazione del tessuto hanno prodotto piattaforme di cultura sofisticata, 3D che consentono indagini controllate in fisiche e chimiche 1) come componenti di matrice microambiente effetto cella comportamenti e 2) l’efficacia di nuovo terapeutico strategie per un certo numero di malattie, compreso i cancri2. Mentre in vitro modelli non possono rappresentare fattori sistemici, quali i segnali di sistema endocrini e sistema immunitario e non possono quindi sostituire completamente in vivo modelli, essi offrono numerosi vantaggi tra cui riproducibilità, controllo sperimentale, convenienza e velocità. Qui, descriviamo l’uso del cervello-mimetici idrogeli in quale 3D culture di cellule di tumore cerebrale derivata da paziente catturano molti aspetti della fisiologia del tumore, in particolare, la dinamica di acquisizione trattamento resistenza3. Rispetto ad altri metodi in vitro , queste culture meglio rappresentano modelli di tumore in vivo e osservazioni cliniche3.
Glioblastoma (GBM) è il tumore più frequente e letale originari del cervello, con una sopravvivenza mediana di soltanto 1-2 anni4,5. Negli ultimi anni, molti studi si sono concentrati sull’influenza dell’ambiente di matrice tumorale in GBM6,7,8. L’unico cervello ECM è stata segnalata per influenzare la resistenza terapeutica6,7,8,9,10,11 , proliferazione e migrazione delle cellule GBM , 12. acido ialuronico (HA) è un abbondanti glicosaminoglicani (GAG) nel cervello, dove interagisce con altre GAGs e proteoglicani per formare un idrogel-come mesh13. Molti studi hanno riferito HA sovraespressione in tumori GBM e suoi effetti successivi il cancro progressione8,9,13,14,15,16 ,17. Altri componenti della MEC colpiscono anche GBM tumore crescita e l’invasione6,7,15,18. Ad esempio, fibronectina e vitronectina, che in genere sono iperespressi in GBM, indurre eterodimerizzazione di recettori di superficie delle integrine tramite l’associazione alla sequenza “RGD” e avviare complesse cascate di segnalazione che favoriscono la sopravvivenza del tumore19 ,20,21. Oltre alle influenze biochimiche, proprietà fisiche della matrice del tessuto anche influenzare GBM progressione22,23.
Continua acquisizione di resistenza alle terapie è uno dei principali driver di GBM letalità4. Farmaci promettenti risultati in modelli 2D o gliomasphere hanno fallito in successivi studi sugli animali e casi clinici3, che indica che gli effetti di fattori microambientali contribuito notevolmente al GBM tumore risposta1. Mentre modelli animali possono fornire un 3D, fisiologicamente appropriato microambiente per xenotrapiantati paziente cellule e generare risultati clinicamente rilevanti24,25, la complessità del cervello microambiente in vivo rende difficile per stabilire quali funzionalità, incluse le interazioni cellula-matrice, sono risultati biologici chiave specifica. Identificazione di nuovi bersagli terapeutici apprezzeranno l’uso di piattaforme di cultura semplificato in cui sono definite le proprietà biochimiche e biofisiche.
A differenza dei modelli precedentemente segnalati biomateriale del GBM microambiente tumorale26,27 , che non hanno raggiunto un vero controllo ortogonale su singole caratteristiche biochimiche e fisiche della ECM, la piattaforma di biomateriale qui segnalati consente il disaccoppiamento dei contributi delle diverse funzioni indipendenti per fenotipo delle cellule GBM. Qui, presentiamo un sistema basato su HA, ortogonalmente sintonizzabile, idrogel per 3D cultura di cellule GBM derivanti dal paziente. Idrogeli sono formati da due componenti del polimero: HA 1) biologicamente attivo e 2) biologicamente inerte polietilenglicole (PEG). PEG è un materiale biocompatibile e idrofilo ampiamente usato con adsorbimento di proteine basso e immunogenicità minimo28. Qui, circa il 5% di moiety acido glucuronico sulle catene di HA sono funzionalizzate con gruppi tiolici per abilitare reticolazione a un commercialmente disponibili 4-braccio-PEG è terminato con le maleimidi via l’aggiunta di Michael-tipo. Nella sua forma più comune nel corpo, HA esiste in catene ad alto peso molecolare (HMW). Qui, un basso grado di modificazione di HMW HA (500-750 kDa) aiuta a preservare interazioni natali di HA e suoi recettori cellulari, tra cui CD4429. Sostituendo il PEG-tiolo per HA-tiolo, mantenendo un costante rapporto molare dei tioli totali per le maleimidi, HA concentrazione può essere separato da proprietà meccaniche nel caso degli idrogeli risultante. Inoltre, stechiometrici controlli possono essere utilizzati per coniugato peptidi cisteina-terminato a un numero definito di medio di terminazione maleimide braccia su ogni 4-braccio-PEG. Incorporazione di peptidi ECM-derivato, adesivi consente interazioni con le integrine su cellule in coltura, attraverso il quale segnali biochimici e chimici sono trasdotte1. Aggiunta di maleimide-tiolo si verifica molto rapidamente in condizioni fisiologiche, riducendo al minimo il tempo necessario per incapsulamento cella e massimizzare sopravvivenza delle cellule derivate dal paziente. Inoltre, idrogel culture possono essere trattate come esemplare tipico del tessuto e sono compatibili con tecniche di caratterizzazione standard tra cui il Western blotting, citometria a flusso e immunofluorescenza. Il seguente protocollo descrive le procedure per la realizzazione di idrogeli, instaurazione 3D delle colture di cellule GBM derivate da paziente e tecniche per l’analisi biochimica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generazione di dati riproducibili utilizzando questo sistema di coltura 3D richiede: 1) coerente-lotto thiolation di HA, 2) pratica per raggiungere efficiente miscelazione dei precursori di idrogel e manipolazione di idrogel culture per evitare danni e 3) ottimizzato semina densità per ogni linea cellulare utilizzato.
Quando una percentuale di peso particolare di HA desiderata nell’idrogel, il grado di thiolation di HA determina la densità di reticolazione. Si consiglia di utilizzare una qua…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato con finanziamenti dal NIH (R21NS093199) e premio della UCLA ARC 3R. I nostri più sentiti ringraziamenti al laboratorio del Dr. Harley Kornblum per fornitura delle linee cellulari HK301 e HK157. Ringraziamo anche UCLA tessuto patologia Core laboratorio (TPCL) per il criosezionamento, funzione di memoria avanzate luce microscopia/spettroscopia (ALMS) in California Nanosystems Institute (CNSI) presso la UCLA per l’uso del microscopio confocale, UCLA Crump Istituto per Imaging molecolare per l’utilizzo del sistema di imaging IVIS, UCLA molecolare strumentazione Center (MIC) per fornire la spettroscopia a risonanza magnetica e flusso Cytometry Core in Jonsson completa Cancer Center (JCCC) presso la UCLA per la fornitura di strumentazione per il flusso cytometry.
Materials
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
Riferimenti
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