ヒアルロン酸を用いた神経膠芽腫患者由来細胞の 3次元培養ヒドロゲル
Summary
ここでは、脳マトリックスを模倣するように設計された直交可変生体内神経膠芽腫患者由来細胞の三次元培養のためのプロトコルを提案する.このアプローチは、生体外で、通常文化で失われた神経膠芽腫細胞体内の多くの特徴を維持する実験のプラットフォームを提供します。
Abstract
膠芽腫 (GBM) は、最も一般的なまだ最も致命的な中枢神経系のがんです。近年、多くの研究は、GBM 進行と侵略のヒアルロン酸 (HA) など、ユニークな脳環境の細胞外マトリックス (ECM) の容易に焦点を当てています。ただし、ほとんどの in vitro培養モデルは、ECM のコンテキスト外にある糸球体基底膜セルを含めます。糸球体基底膜細胞のマウス異種移植片、一般的にも使用されます。生体内でモデルを腫瘍の挙動に複雑な腫瘍微小環境の個々 の機能の貢献を分離することは困難に作る。ここでは、研究者 HA 濃度と剛性を個別に変更することができる HA ハイドロゲルを用いた、三次元 (3 D) 文化プラットフォームについて述べる。高分子量 HA とポリエチレング リコール (PEG) は生きているセルの存在下でミハエル機追加を通して架橋ゲルを構成します。三次元ハイドロゲル培養患者由来 GBM 細胞展示生存と増殖率として、またはそれ以上のとき、培養として標準的な gliomaspheres。ハイドロゲルは ECM 擬態ペプチド相互作用特定セル ECM の効果を分離するための設立も実現します。ゲルは、生きた細胞三次元培養で視覚化されるように光学的透明です。最後に、HA ハイドロゲル文化は、分子・細胞解析、PCR、西部にしみが付くこと、セクショニング蛍光染色により観察が続くなどの標準的な技術と互換性があります。
Introduction
三次元 (3 D) 培養システムは、ネイティブ組織よりも、二次元 (2 D) 対応1,2セルとその周辺の細胞外マトリックス (ECM) との間の相互作用を要約します。組織工学の進歩は、新しい制御マトリックス微小環境に影響を与える細胞の挙動と 2) の有効性の調査 1) 化学および物理コンポーネントを有効にする、3 D の高度な文化のプラットフォームを得られている治療多くの病気、癌2を含むための戦略。体外モデル内分泌及び免疫能の信号などの全身的要因のアカウントできません、したがって体内モデルを置き換えることはできません完全に、彼らは再現性、実験コントロールを含むいくつかの利点を提供します。手頃な価格と速度です。ここでは、3 D で患者由来脳腫瘍細胞の培養が腫瘍生理、特に治療抵抗3を獲得の原動力の多くの側面をキャプチャ脳模倣ヒドロゲルの使用について述べる。これらの文化はより生体内で腫瘍モデルと臨床的観察3を表す他の方法と比べて。
膠芽腫 (GBM) は、わずか 1 〜 2 年4、5の生存期間中央値で、脳で発生した最も頻繁に、致命的ながんです。近年、多くの研究は、腫瘍 GBM6,7,8マトリックス環境の影響に焦点を当てています。ユニークな脳 ECM は、GBM 細胞遊走・増殖・治療抵抗6,7,8,9,10,11に影響を与えると報告されています。,12. ヒアルロン酸 (HA) は、他のギャグと対話するハイドロゲルのような形のためのプロテオグリカン メッシュ13脳豊富なグリコサミノグリカン (GAG)。多くの研究は、GBM の腫瘍における HA の過剰発現と癌の進行8,9,13,14,15,16、それ以降の効果を報告しています。 ,17。他の ECM の部品には、糸球体基底膜腫瘍増殖および浸潤6,7,15,18も影響します。たとえば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、糸球体基底膜に過剰に発現している通常、「rgd」へのバインディングを介して細胞表面のインテグリン受容体 heterodimerization を誘発腫瘍の生存19 を促進する複雑なシグナル伝達カスケードを開始 ,20,21。組織のマトリックスの物理的性質は生化学的な影響のほか、糸球体基底膜の進行22,23も影響します。
治療に抵抗性の継続的な獲得は、GBM 致死率4の主な要因の 1 つです。2D または gliomasphere モデルの有望な結果を示す薬物は、その後の動物の研究と臨床例3を示す樹状細胞の効果は、GBM の腫瘍の応答1に著しく貢献した失敗しています。動物モデルは、3 D を提供できますが、生理学的に異種の患者細胞の微小環境を適切なし、臨床的に関連性の高い結果24,25, 脳微小環境、生体内での複雑さを生成機能、細胞マトリックスの相互作用を含む特定する主要な生物学的成果を決定するために挑戦になります。新しい治療標的の同定は生化学的および生物物理プロパティが定義されている簡略化された文化のプラットフォームを使用しての恩恵を受ける。
ECM、生体材料プラットフォームの個々 の生化学的および物理的な機能を真に直交制御を達成していない GBM の腫瘍微小環境26,27以前に報告した生体材料のモデルとは異なりここを有効に報告されたは、GBM 細胞表現型に複数の独立した機能の貢献のデカップリング。GBM 患者由来細胞の 3次元培養用 HA ベース、直交可変ハイドロゲル システムを紹介します。ヒドロゲルは二成分ポリマーから形成される: 1) 生理活性 HA、2) 生物学的に不活性ポリエチレング リコール (PEG)。ペグは、低蛋白質の吸着と最小限の免疫原性28広く使用されている生体適合性と親水性材料です。ここで、HA 鎖グルクロン酸基の約 5% は市販 4-腕-ペグ ミハエル機追加を通してマレイミドと終了する架橋結合を有効にするチオール基と官能基化します。体の最も一般的な形式として、HA は高分子量分画法のチェーンに存在します。ここでは、HMW HA (500-750 kDa) の変更の度に HA とその細胞の受容体、CD4429を含むネイティブ相互作用を維持するために役立ちます。置き換えて PEG チオール HA チオールのマレイミドに総チオールの一定モル比を維持しながら、結果として得られるゲルの力学特性から HA 濃度を切り離すことができます。さらに、定義された平均数各 4 腕ペグ マレイミド化武器にペプチドのシステインで終わるを共役に理論空燃比のコントロールを使用できます。ECM から派生した、接着性ペプチドの設立により、生化学的・化学的信号が導入された1細胞のインテグリンとの相互作用。マレイミド チオール添加は、電池封止材と患者由来細胞の生存を最大にするために必要な時間を最小限に抑え、生理条件下で非常に迅速に発生します。また、ハイドロゲル文化は典型的な組織標本のような扱うことができる、西部にしみが付くこと、フローサイトメトリー、蛍光染色など標準的な技術と互換性が。次のプロトコルでは、ハイドロゲル、GBM 患者由来細胞と生化学分析のための技術の 3 D の文化の確立を製造するための手順について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この 3 D 培養系を用いた再現性のあるデータの生成が必要です: HA、2) 効率的なヒドロゲル前駆体の混合とハイドロゲルの処理を達成するために練習の 1) 一貫したバッチ間なチオール化文化の損傷を防ぐため、3) 播種に最適化使用される各セルラインの密度です。
ヒドロゲルの HA の特定の重量の割合が必要な ha なチオール化の程度は、架橋密度を決定します。ハ各なチ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH (R21NS093199) とカリフォルニア大学ロサンゼルス校アーク 3 r の賞からの資金でサポートされていました。私たちの心からの感謝は、博士ハーレー Kornblum の HK301 と HK157 のセル行の規定の研究室に行きます。我々 もありがとう UCLA 組織病理コア研究室 (TPCL) セクショニング、高度な光顕微鏡/分光法中核施設 (施し) ucla カリフォルニア ・ ナノシステム研究所 (CNSI) の共焦点顕微鏡、UCLA crump さん所の使用のためIVIS イメージング システム、カリフォルニア大学ロサンゼルス校分子計測センター (MIC) 流れのインストルメンテーションを提供する磁気共鳴分光法と流れ Cytometry コアでジョンソン総合がんセンター (日数) ucla を提供するための分子イメージングフローサイトメトリー。
Materials
| pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
| Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
| Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
| dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
| 2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
| sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
| Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
| Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
| Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
| Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
| 0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
| Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
| 4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
| 4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
| L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
| RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
| silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
| complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
| patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
| 20G needle | BD medical | 305175 | |
| 1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
| 10mL syringe | BD medical | 302995 | |
| RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
| protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
| vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
| 70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
| D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
| fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
| Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
| Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
| HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
| Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
| Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
| Dry Ice | N/A | N/A |
Riferimenti
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