Här presenterar vi ett protokoll för tredimensionella kultur av patientderiverade glioblastoma celler inom ortogonalt avstämbara biomaterial utformade för att efterlikna hjärnans matrisen. Detta tillvägagångssätt ger en in vitro-, Experimentell plattform som underhåller många egenskaper i vivo glioblastoma celler normalt förlorade i kultur.
Glioblastom (GBM) är den vanligaste och mest dödliga, centrala nervsystemet cancern. Under de senaste åren har många studier fokuserat på hur de extracellulär matrixen (ECM) unik hjärnan miljön, såsom hyaluronsyra (HA), underlättar GBM progression och invasion. Men inkluderar de flesta i vitro kultur modeller GBM celler utanför ramen för en ECM. Murina xenograft GBM celler används vanligen också. I vivo modeller gör det dock svårt att isolera bidrag från enskilda funktioner i den komplexa tumör närmiljön till tumör beteende. Här beskriver vi en HA hydrogel-baserade, tredimensionella (3D) kultur plattform som tillåter forskare att självständigt ändra HA koncentration och stelhet. Ultrahög molekylvikt HA och polyetylenglykol (PEG) omfattar hydrogels, som är tvärbundna via Michael-typ tillägg i närvaro av levande celler. 3D hydrogel kulturer av patientderiverade GBM celler uppvisar lönsamhet och spridning priser lika bra som eller bättre än, när odlade som standard gliomaspheres. Hydrogel systemet möjliggör också införlivandet av ECM-mimetiska peptider för att isolera effekterna av särskilda cell-ECM interaktioner. Hydrogeler är optiskt transparenta så att levande celler kan avbildas i 3D kultur. Slutligen är HA hydrogel kulturer kompatibla med standardtekniker för molekylära och cellulära analyser, inklusive PCR, Western blotting och kryosnitt följt av immunofluorescens färgning.
Tredimensionella (3D) kultur system recapitulate interaktioner mellan celler och deras omgivande extracellulär matrix (ECM) i native vävnader bättre än deras tvådimensionell (2D) motsvarigheter1,2. Framsteg inom vävnadsteknik har gett sofistikerade, 3D kultur plattformar som möjliggör kontrollerade undersökningar (1) hur kemiska och fysiska komponenter av matrix närmiljön påverkar cellen beteenden och 2) effekten av nya terapeutiska strategier för ett antal sjukdomar, däribland cancer2. Även om in vitro- modeller kan inte redogöra för systemisk faktorer, såsom endokrina och immun signaler, och således kan inte helt ersätta i vivo modeller, ger de flera fördelar inklusive reproducerbarhet, experimentell kontroll, överkomliga priser och hastighet. Här, beskriver vi användning av hjärnan-mimetiska hydrogels i vilken 3D kulturer patientderiverade hjärnan tumörceller fånga många aspekter av tumör fysiologi, särskilt dynamiken i förvärva behandling resistance3. Jämfört med andra in vitro- metoder, representera dessa kulturer bättre i vivo tumör modeller och kliniska observationer3.
Glioblastom (GBM) är den mest frekventa och dödliga cancer med ursprung i hjärnan, med en medianöverlevnad på bara 1-2 år4,5. Under de senaste åren har många studier fokuserat på påverkan av tumör matrix miljö i GBM6,7,8. Unik hjärnan ECM har rapporterats påverka GBM cellmigration, proliferation och terapeutiska motstånd6,7,8,9,10,11 , 12. hyaluronsyra (HA) är en rikligt glykosaminoglykan (GAG) i hjärnan, där det interagerar med andra GAGs och proteoglykaner till bildar ett hydrogel-liknande mesh13. Många studier har rapporterat HA överuttryck i GBM tumörer och dess efterföljande effekter på cancer progression8,9,13,14,15,16 ,17. Andra ECM komponenter också påverka GBM tumör tillväxt och invasion6,7,15,18. Till exempel Fibronektin och Aktiebolaget Trav & Galopp, vilket är vanligtvis ökad utsträckning hos GBM, framkalla heterodimerization av cellen ytbehandlar integrin receptorer genom bindning till sekvensen ”RGD” och initiera komplexa signalering kaskader som främjar tumör överlevnad19 ,20,21. Förutom biokemisk påverkan påverka fysikaliska egenskaper av vävnadsmatris också GBM progression22,23.
Kontinuerliga förvärv av resistens mot terapier är en av de viktigaste drivkrafterna för GBM dödlighet4. Droger som visar lovande resultat i 2D- eller gliomasphere modeller har misslyckats i efterföljande djurstudier och kliniska fall3, som visar att effekterna av microenvironmental faktorer bidragit till GBM tumör svar1. Även djurmodeller kan ge en 3D, fysiologiskt lämplig mikromiljö xenografted patientens celler och generera kliniskt relevanta resultat24,25, komplexiteten i den hjärnan närmiljön i vivo gör det utmanande för att avgöra vilka funktioner, inklusive cell-matrix interaktioner, är nyckeln till specifika biologiska utfall. Identifiering av nya terapeutiska mål kommer att dra nytta av användningen av förenklade kultur plattformar som biokemiska och biofysiska egenskaper definieras.
Till skillnad från tidigare rapporterade biomaterial modeller av GBM tumör mikromiljö26,27 som inte har uppnått sann ortogonala kontroll över enskilda biokemiska och fysiska funktioner av ECM, biomaterial plattformen rapporterade här möjliggör frikoppling av bidrag från flera oberoende funktioner till GBM cell fenotyp. Här presenterar vi ett HA-baserade, ortogonalt avstämbara, hydrogel system för 3D kultur av patientderiverade glioblastoma Multiforme celler. Hydrogeler bildas från två polymerkomponenter: (1) biologiskt aktiva HA och 2) biologiskt inert polyetylenglykol (PEG). PEG är en allmänt använd biokompatibelt och hydrofila material med låg protein adsorption och minimal immunogenicitet28. Här, ca 5% av glukuronsyra sura beståndsdelarna på HA kedjor är functionalized med thiol grupper att aktivera crosslinking till en kommersiellt tillgänglig 4-arm-PEG avslutas med maleimides via Michael-typ tillägg. I sin vanligaste form i kroppen finns HA i ultrahög molekylvikt (HMW) kedjor. Här, en låg grad av modifiering HMW hektar (500-750 kDa) hjälper till att bevara infödda interaktioner av HA och dess cellreceptorer, inklusive CD4429. Genom att ersätta PEG-tiol för HA-thiol bibehållen en konstant molar förhållandet av totala tioler till maleimides, kan HA koncentration frikopplas från mekaniska egenskaper av den resulterande hydrogels. Stökiometriska kontroller kan dessutom användas till cystein-avslutad peptider att en definierad Genomsnittligt antal maleimide-avslutad armar på varje 4-arm-PEG-konjugat. Införlivandet av ECM-derived, självhäftande peptider kan interaktioner med integriner på odlade celler, genom vilka biokemiska och kemiska signaler är sensorik1. Maleimide-thiol tillägg uppstår mycket snabbt under fysiologiska betingelser, minimera tidsåtgången för cell inkapsling och maximera överlevnad patientderiverade celler. Dessutom hydrogel kulturer kan behandlas som typiska vävnad preparatet och är kompatibel med standard karakterisering tekniker inklusive Western blotting, flödescytometri och immunofluorescens färgning. Följande protokoll beskriver förfarandena för att fabricera hydrogels, upprätta 3D cellkulturer patientderiverade GBM och tekniker för biokemisk analys.
Generering av reproducerbara data med detta 3D kultur system kräver: 1) konsekvent sats till sats thiolation ha, 2) praxis för att uppnå effektiv blandning av hydrogel prekursorer och hantering av hydrogel kulturer för att förhindra skador och 3) optimerad sådd densitet för varje cell linje används.
När en viss viktprocent av HA önskas i hydrogel, avgör graden av thiolation av HA crosslink densitet. Vi rekommenderar att du använder en konsekvent mängd HA för varje thiolation reak…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds med finansiering från NIH (R21NS093199) och den UCLA ARC 3R’s Award. Vår uppriktiga tack till labbet av Dr. Harley Kornblum för tillhandahållande av HK301 och HK157 cellinjer. Vi tackar också UCLA vävnad patologi Core laboratorium (TPCL) för kryosnitt, avancerade ljus Microscopy/spektroskopi core facilitet (ALMS) i California Nanosystems Institute (CNSI) vid UCLA för användning av confocal mikroskopet, UCLA Crump Institutet för Molekylär avbildning för att använda IVIS bildsystem, UCLA molekylär Instrumentation Center (MIC) för att tillhandahålla magnetisk resonans spektroskopi och flöde flödescytometri Core i Jonsson omfattande Cancer Center (JCCC) vid UCLA för att tillhandahålla instrumentering för flödet flödescytometri.
pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
20G needle | BD medical | 305175 | |
1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
10mL syringe | BD medical | 302995 | |
RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
Dry Ice | N/A | N/A |