Her presenterer vi en protokoll for tredimensjonale kultur av pasient-avledede glioblastom celler i ortogonalt tunable biologisk materiale designet for å etterligne brain matrix. Denne tilnærmingen gir en i vitro, eksperimentelle plattform som opprettholder mange egenskaper i vivo glioblastom celler vanligvis mistet i kultur.
Glioblastom (GBM) er den vanligste, men mest dødelige, sentralnervesystemet kreften. De siste årene, har mange studier fokusert på hvordan den ekstracellulære matrisen (EFM) av unike hjernen miljøet, for eksempel hyaluronic syre (HA), forenkler GBM progresjon og invasjon. Men inkluderer de fleste i vitro kultur modeller GBM celler utenfor rammen av en ECM. Murine xenografts GBM celler brukes ofte også. Men gjør i vivo modeller det vanskelig å isolere bidrag av enkeltfunksjonene i komplekse svulst microenvironment svulst virkemåten. Her beskriver vi en HA hydrogel-basert, tredimensjonale (3D) kultur plattform som tillater forskere å endre uavhengig HA konsentrasjon og stivhet. Høy molekylvekt HA og polyetylenglykol (PEG) utgjør hydrogels, som er krysskoblet via Michael-type tillegg i nærvær av lever celler. 3D hydrogel kulturer av pasient-avledede GBM celler utstillingen levedyktighet og spredning priser så godt som eller bedre enn når kultivert som standard gliomaspheres. Hydrogel systemet kan også innlemmelse av ECM-mimetic peptider å isolere effektene av bestemt celle-ECM interaksjoner. Hydrogels er optisk gjennomsiktig slik at levende celler kan avbildes i 3D kultur. Endelig er HA hydrogel kulturer kompatibel med standard teknikker for molekylær og cellulær analyser, inkludert PCR, vestlige blotting og og kryosnitt etterfulgt av immunofluorescence flekker.
Tredimensjonale (3D) kultur systemer recapitulate interaksjoner mellom celler og deres omkringliggende ekstracellulær matrix (EFM) i eget vev bedre enn deres todimensjonal (2D) kolleger1,2. Fremskritt i vev engineering har gitt sofistikerte, 3D kultur plattformer som gjør kontrollerte undersøkelser i 1) hvordan kjemiske og fysiske komponenter av matrix microenvironment påvirker celle atferd og 2) effekt av nye terapeutiske strategier for en rekke sykdommer, inkludert kreft2. Mens i vitro modeller ikke gjenkjenner systemiske faktorer, for eksempel endokrine og immun-signaler, og dermed kan ikke helt erstatte i vivo modeller, gir de flere fordeler inkludert reproduserbarhet, eksperimentelle kontroll, rimelig og hastighet. Her beskriver vi bruk av hjernen-mimetic hydrogels i hvilken 3D kulturer pasient-avledede svulst cellene fange mange aspekter av svulst fysiologi, spesielt dynamikken for behandling motstand3. Sammenlignet med andre i vitro -metoder, representerer disse kulturene bedre i vivo svulst modeller og kliniske observasjoner3.
Glioblastom (GBM) er den mest hyppig og dødelig kreften opprinnelse i hjernen, med en gjennomsnittlig overlevelse av bare 1-2 år4,5. De siste årene, har mange studier fokusert på påvirkning av svulst matrix miljø i GBM6,7,8. Unik hjernen ECM har blitt rapportert å påvirke GBM celle migrasjon, spredning og terapeutiske motstand6,7,8,9,10,11 , 12. Hyaluronic syre (HA) er en rikelig glycosaminoglycan (GAG) i hjernen, hvor den kommuniserer med andre GAGs og proteoglycans å danne et hydrogel-lignende mesh13. Mange studier har rapportert HA overuttrykte i GBM svulster og dens påfølgende effekter på kreft progresjon8,9,13,14,15,16 ,17. Andre ECM komponenter også påvirke GBM tumor vekst og invasjonen6,7,15,18. For eksempel fibronectin og vitronectin, som er vanligvis overexpressed i GBM, indusere heterodimerization av cellen overflaten integrin reseptorer gjennom binding til “RGD” sekvensen og starte komplekse signalnettverk cascades som fremmer svulst overlevelse19 ,20,21. Foruten biokjemiske påvirkninger påvirke fysiske egenskaper av vev matrix også GBM progresjon22,23.
Kontinuerlig oppkjøpet av motstand mot terapi er en av de viktigste driverne GBM dødelighet4. Narkotika viser lovende resultater i 2D eller gliomasphere modeller har sviktet i påfølgende dyrestudier og kliniske tilfeller3, som angir at effekten av microenvironmental faktorer bidratt betydelig til GBM tumor respons1. Mens dyremodeller kan gi en 3D, fysiologisk passende microenvironment xenografted pasienten celler og generere klinisk relevante resultater24,25, kompleksiteten av hjernen microenvironment i vivo gjør det utfordrende å finne ut hvilke funksjoner, inkludert celle-matrix interaksjoner, er nøkkelen til bestemte biologiske resultater. Identifikasjon av nye terapeutiske mål vil dra nytte av forenklet kultur der biokjemiske og Biofysiske egenskaper er definert.
I motsetning til tidligere rapporterte biomateriale modeller GBM svulst microenvironment26,27 som ikke har oppnådd ekte ortogonale kontroll over enkelte biokjemiske og fysiske funksjonene til ECM, biomateriale plattformen rapporterte her gjør frikopling av bidrag av flere uavhengige funksjoner GBM celle fenotypen. Her presenterer vi et HA-basert, ortogonalt tunable, hydrogel system for 3D kultur pasient-avledede GBM celler. Hydrogels er dannet av to polymerkomponenter: 1) biologisk aktive HA og 2) biologisk inert polyetylenglykol (PEG). PEG er en mye brukt biokompatible og hydrofile materiale med lav protein adsorpsjon og minimal immunogenisitet28. Her er ca 5% av glucuronic syre moieties på HA kjeder functionalized med thiol grupper å aktivere crosslinking til en kommersielt tilgjengelig 4-arm-pinne ble avsluttet med maleimides via Michael-type tillegg. I sin vanligste form i kroppen finnes HA i høy molekylvekt (HMW) kjeder. Her, bidrar en lav grad av endringen av HMW HA (500-750 kDa) til å bevare opprinnelige interaksjoner HA og dens celle reseptorer, inkludert CD4429. Ved å erstatte PEG-thiol for HA-thiol samtidig opprettholde konstant molar forholdet totalt thiols til maleimides, kan HA konsentrasjon være skilt fra mekaniske egenskaper av den resulterende hydrogels. Videre kan stoichiometric kontroller brukes å bøye cystein slutter peptider til en definert gjennomsnittlig antall maleimide-avsluttet armene på hver 4-arm-pinne. Innlemmelse av ECM-avledet, selvklebende peptider kan interaksjon med integrins på kulturperler celler, som biokjemiske og kjemiske signalene er transduced1. Maleimide-thiol tillegg skjer veldig fort under fysiologiske forhold, minimere tiden som kreves for cellen innkapsling og maksimere overlevelse av pasient-avledet celler. Videre hydrogel kulturer kan bli behandlet som vanlig vev prøven og er kompatible med standard karakteristikk teknikker inkludert vestlige blotting, flowcytometri og immunofluorescence flekker. Følgende protokollen beskriver prosedyrene for fabrikasjon hydrogels, etablere 3D kulturer av pasient-avledede GBM celler og teknikker for biokjemiske analyse.
Generering av reproduserbar data ved hjelp av denne 3D kultur-systemet krever: 1) konsekvent parti til parti thiolation av HA, 2) praksis for å oppnå effektiv blanding av hydrogel prekursorer og håndtering av hydrogel kulturer for å unngå skade og 3) optimalisert såing tetthet for hver celle linje brukes.
Når en bestemt vekt andelen HA er ønsket i hydrogel, bestemmer graden av thiolation av HA krysskobling tetthet. Vi anbefaler å bruke en konsekvent mengde HA for hver thiolation reaks…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med finansiering fra NIH (R21NS093199) og UCLA ARC 3R Award. Våre sincerest takk går til lab av Dr. Harley Kornblum for levering av cellelinjer HK301 og HK157. Vi takker også UCLA vev patologi Core Laboratory (TPCL) for og kryosnitt, avansert lys mikroskopi/spektroskopi kjernen anlegg (ALMISSE) i California Nanosystems Institute (CNSI) ved UCLA for bruk av AC confocal mikroskop, UCLA tørkes Institutt for Molekylær Imaging for å bruke IVIS tenkelig system, UCLA molekylær instrumentering Center (mikrofon) for å gi magnetisk resonans spektroskopi og flyt cytometri kjernen i Jonsson omfattende Cancer Center (JCCC) ved UCLA for å gi instrumentering for flyt cytometri.
pH meter | Thermo Fisher | N/A | Any pH meter that has pH 2-10 sensitivity |
Stir plate | Thermo Fisher | N/A | General lab equipment |
Erlenmeyer flask (125mL) | Thermo Fisher | FB-501-125 | |
dialysis tubes | Thermo Fisher | 21-152-14 | |
2L polypropylene beaker | Thermo Fisher | S01916 | |
sodium hyaluronan | Lifecore | HA700k-5 | 500-750 kDa range |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo Fisher | PI-22980 | |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | sigma aldrich | 130672-5G | |
Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher | SA48-500 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher | SS266-1 | |
Cystamine dihydrochloride | Thermo Fisher | AC111770250 | |
Dithiolthreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172-25 | |
Ellman's test reagent (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoic acid | Sigma Aldrich | D218200-1G | |
Deuterated water (deuterium oxide) | Thermo Fisher | AC166301000 | |
0.22µm vacuum driven filter | CellTreat | 229706 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher | P32080-100T | |
Hanks' balanced salt saline (HBSS) | Thermo Fisher | MT-21-022-CV | |
4-arm-PEG-maleimide | JenKem Technology | A7029-1 | molecular weight around 20kDa |
4-arm-PEG-thiol | JenKem Technology | A7039-1 | molecular weight around 20kDa |
L-Cysteine | sigma aldrich | C7880-100G | |
RGD ECM mimetic peptide | Genscript Biotech | N/A | Custom peptide with sequence "GCGYGRGDSPG", N-terminal should be acetylated |
silicone molds | Sigma Aldrich | GBL664201-25EA | Use razor blade to cut into single pieces |
complete culture medium | Various | Various | DMEM/F12 (Thermofisher) with non-serum supplement (G21 from GeminiBio), epidermal growth factor 50ng/mL (Peprotech), fibroblast growth factor 20ng/mL (Pepro Tech) and heprain 25µg/mL (Sigma Aldrich), culture medium varies in different labs |
patient derived GBM cell | N/A | N/A | |
20G needle | BD medical | 305175 | |
1mL syringe | Thermo Fisher | 14-823-434 | |
10mL syringe | BD medical | 302995 | |
RIPA Buffer | Thermo Fisher | PI-89901 | |
protease/phosphatase inhibitor mini tablet | sigma aldrich | 5892970001 | |
vortex shaker | Thermo Fisher | 12-814-5Q | |
TrypLE express | Thermo Fisher | 12604013 | |
70µm cell strainer | Thermo Fisher | 22-363-548 | |
Paraformaldehyde | Thermo Fisher | AC416785000 | Dissolve 4% (w/v) in PBS, keep pH 7.4 |
D-sucrose | Thermo Fisher | BP220-1 | |
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Thermo Fisher | NC9373881 | |
Cell culture incubator | Thermo Fisher | N/A | Any General One with 5% CO2 and 37C |
fridge/freezer | Thermo Fisher | N/A | Any General Lab equipment with -20C and -80C capacity |
Disposable embedding molds | Thermo Fisher | 12-20 | |
Lyapholizer | Labconco | N/A | Any -105C freeze dryers |
HEPES | Thermo Fisher | BP310-500 | |
Amber vial | Kimble Chase | 60912D-2 | |
Wide orifice pipette tips | Thermo Fisher | 9405120 | |
2-methylbutane | Thermo Fisher | 03551-4 | |
Dry Ice | N/A | N/A |