Intraluminal filament okklusjon av arterien cerebri er det mest brukte i vivo modellen av eksperimentelle slag i gnagere. En alternativ kirurgisk tilnærming å tillate vanlige arteria carotis reparasjon utføres her, som tillater reperfusion av carotis og en full reperfusion til arteria cerebri territorium.
Den iskemiske hjerneslag er en viktig årsak til voksen langsiktige uførhet og død over hele verden. Gjeldende behandlinger tilgjengelig er begrenset, og bare vev plasminogen aktivator (tPA) som en godkjent behandling å målrette iskemiske hjerneslag. Nåværende forskning innen iskemiske hjerneslag fokuserer på bedre forståelse for Patofysiologien ved slag, utvikle og undersøke novel farmasøytiske mål. Pålitelig eksperimentelle slag modeller er avgjørende for utviklingen av mulige behandlinger. Arteria cerebri okklusjon (MCAO) modellen er klinisk relevant og de mest brukte kirurgisk modell av iskemiske hjerneslag i gnagere. Men er resultatene av denne modellen, som lesjon volum, forbundet med høye nivåer av variasjon, spesielt i mus. Alternativ MCAO modellen beskrevet her kan reperfusion av carotis communis (CCA) og den økte perfusjonen av arteria cerebri (MCA) territorium, bruke en vev pad med fibrinogen-baserte tetningsmasse for å reparere skipet og en forbedret velferd av mus ved å unngå eksterne arteria carotis (ECA) hemorroider. Dette reduserer avhengigheten av sirkelen Willis, som er kjent for å være svært anatomisk variabel i mus. Representant data viser at med denne alternative kirurgisk tilnærming reduserer variasjon i lesjon volumer mellom den tradisjonelle tilnærmingen for MCAO og den alternative fremgangsmåten beskrevet her.
En viktig årsak til et hjerneslag er fokal iskemi i territoriet til arterien cerebri. Vev plasminogen aktivator (tPA) er bare farmakologisk behandling tilgjengelig med påvist effekt, til tross for mange kliniske studier av narkotika rettet mot iskemiske hjerneslag1,2. Imidlertid sikkerhet bekymringer og et smalt terapeutiske vindu (< 4.5 h), bare ~ 15% av alle slagpasienter, få tPA og recanalization priser kan være < 50%3,4.
Reproduserbar og klinisk relevant dyremodeller av hjerneslag anses viktig å informere utviklingen av nye og potensielle slag terapeutiske behandlinger. På grunn av bekymringer om konsistens og variasjon i resultatene med dyr modeller er det imidlertid viktig å avgrense eksisterende i vivo modeller for å forbedre oversettelsen fra prekliniske studier til klinikken. Mangel på oversettelse fra prekliniske eksperimentelle effekten av potensielle behandlinger klinisk bruk er en pågående bekymring for hjerneslag forskning5. Årsaker til svikt i oversettelse vil være flere kan være relatert til, for eksempel prøve design, behandling forsinkelser, klinisk slag heterogenitet, og begrensningene for dyremodeller6. En viktig utfordring for Neuroscience fortsatt utvikling av sikker og effektiv behandling.
Arteria cerebri okklusjon (MCAO) ved intraluminal filament innsetting er den mest brukte i vivo gnager modellen av eksperimentelle strøk. Denne modellen gjør restaurering av blodstrøm etter en iskemi induksjon, etterligne hendelser som oppstår i menneskelige slag7. Spesielt i mus oppstår heterogene lesjon volumer med variert standardavvik imidlertid selv om definert kirurgisk protokoller er anvendt8,9,10. Det er vanlig å se en bimodale fordeling av små striatal og store striato-kortikale lesjon volumer11. For å indusere iskemi, settes filament vanligvis gjennom et snitt CCA eller ECA som forblir permanent samskrevet12. Den permanente ligation av CCA forhindrer av blodgjennomstrømningen i den interne arteria carotis (ICA) og, senere, MCA territoriet. Dette fører reperfusion å være avhengig av sivile tilbudet i sirkelen av Willis (kua). Ku strukturen har anatomiske variasjoner mellom enkelte dyr, spesielt i C57BL/6 mus-en belastning brukes vanligvis i i vivo slag forskning13. En alternativ metode for filament innsetting gjennom ECA, tillater den fortsatte perfusjonen gjennom CCA, men denne metoden kompromisser arterial tilførsel til ECA territorium, som har vist, i rotter, å ha en skadelig effekt på dyr velvære14.
Avhengigheten av kua for sikkerhetsstillelse forsyning og reperfusion i etablerte MCAO modellen kan delvis utgjør lesjon volum variasjon etter okklusjon. Vi beskriver en alternativ murine kirurgisk prosedyre der ECA ligation unngås og CCA innsnitt er reparert, og tillater reperfusion gjennom CCA, uavhengig av kua. Reparasjon av CCA innsnitt har vist tidligere i rotter å føre en vellykket reperfusion gjennom CCA15. Vi har brukt denne tilnærmingen i mus11 og rapportere her protokollen som resulterer i en redusert variasjon i lesjon volum, viktigste utfallet tiltaket brukt i eksperimentell slag studier.
I denne protokollen viser vi hvordan å gjennomføre MCAO gjennom CCA fartøyet filament innsetting etterfulgt av CCA fartøyet reparasjon, som innebærer en vev pad og tetningsmasse søknad å tillate reperfusion.
Filament induksjon av forbigående MCAO i gnagere er mest brukte eksperimentelle slag modellen, som det tillater reperfusion til det berørte området, etterligne forekomsten av hendelser etter klinisk iskemiske hjerneslag7. Rapporterte her er en alternativ kirurgisk tilnærming til den tradisjonelle metoden for filament-indusert forbigående MCAO i mus. Alternativ tilnærming, som involverer analgesi behandling, ECA ligation unngåelse og CCA snitt reparasjon, resulterer i en redusert LV variasjon når vurdert hjelp MRI og histologiske flekker metoder11.
Tradisjonelle tilnærminger å indusere MCAO i stor grad stole på transection, eller på minst ligation, av ECA, som har vist, i rotter, å påvirke drikker atferd og en økning i kroppen vekttap etter MCAO14. Protokollen definert her, i mus, med unngåelse av ECA ligatur og analgesi tillegg foreslo en reduksjon i kroppen vekttap etter MCAO med nei bevirke på lesjon volumet. Bruk av analgesi er unngått, eller i det minste ikke rapportert, i fleste eksperimentelle slag studier, på grunn av mulige forvirrende effekter på eksperimentell utfallet. Men unngå analgesi helt ikke alltid rettferdiggjøres og det er behov for å balansere velferd behov dyrene av de vitenskapelige målsettingene.
Forskjeller i dyr størrelse, belastning og cerebrovascular anatomi, i tillegg til filament størrelse og type variasjoner, er alle foreslo for å påvirke slag resultater23,24. Den alternative fremgangsmåten beskrevet her unngår avhengigheten kua under reperfusion, dermed redusere, minst delvis variasjon sett mellom dyr i lesjon volum. Ku anatomi er svært variabel i mus, spesielt i C57BL /6 belastning, som ofte brukes i eksperimentell slag studier. 90% av C57BL/6 mus har en ufullstendig kua på grunn av en variert bakre kommuniserende arterie (PcomA) patency, som kan ha en effekt på volumet av iskemiske skader på grunn av utilstrekkelig perfusjon av strukturer utenfor den MCA territorium13, 25. reparasjon CCA i mus, som vist her, resultat av blod flyte via CCA iskemiske området, som tidligere beskrevet i rotter15. Representant data her viser at reparasjon av CCA øker reperfusion, selv om blodstrømmen i CCA ikke var direkte målt. Det er imidlertid mulig for kirurgen visualisere CCA reperfuse med blod etter reparasjon, er fartøy som returneres til en pulserende og full tilstand langs bagasjerommet, proksimale og distale til reparasjon stedet. Dette visuell bekreftelse, sammen med laser Doppler flowmetry målinger av iskemiske området, kan brukes til å bekrefte vellykket reparasjon av fartøyet. Tiden mellom vev pad søknaden og fjerning av fartøyet klippet fra CCA kan ha innvirkning på den resulterende patency av CCA, som reduserer tiden mellom vev pad programmet og klipp fjerning vil forhindre vev puten følge o pposite siden av CCA. Selv om teknisk utfordrende, krever ikke den alternative MCAO prosedyren forklart her noen flere ferdigheter enn de som kreves for å utføre kirurgisk induksjon av MCAO i mus.
Tradisjonelt blir assosiert med en høy variasjon i utfallsmål, kan eksperimentelle slag studier ha en tendens til å være underpowered. Etiske og velferd krav i kombinasjon med økonomisk og praktisk bekymringer kan bidra til studier er underpowered. Ved å redusere variasjon i utfallet, og derfor produserer mer konsekvent lesjon resultater over en forsøksgruppen, kan mer effektiv makt beregninger utføres med det endelige målet for studier å være hensiktsmessig drevet.
Avslutningsvis denne alternative CCA reparasjonsprosedyren, i mus, resulterer i mindre variasjon i lesjon volum etter eksperimentelle slag og gjør mindre eksperimentelle grupper behov for testing en behandlingseffekt når passende makt beregninger brukes.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av National Centre for erstatning, raffinement og reduksjon av dyr i forskning (NC3Rs; NC/M000117/1 til CG). Forfatterne takker hos divisjon i biomedisinsk Services, University of Leicester, til vedlikehold av forsøksdyr og Maria Viskaduraki for hennes statistiske råd. Representant resultatene er tilpasset med tillatelse fra Disease modeller & mekanismer11.
0.7mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight – use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2ml |
Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel – manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx – rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
sterile petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50mm sterile petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50mm diameter is required. |
Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |