Intraluminal glødetrådens okklusion af den midterste cerebral arterie er den hyppigst anvendte i vivo model af eksperimentelle slagtilfælde i gnavere. En alternativ kirurgisk tilgang til at tillade fælles halspulsåren reparation udføres her, som tillader reperfusion af den fælles halspulsåren og en fuld reperfusion til den midterste cerebral arterie område.
Iskæmisk slagtilfælde er en væsentlig årsag til voksen langsigtede handicap og dødsfald på verdensplan. De nuværende behandlinger er begrænset, med kun væv plasminogen aktivator (tPA) som et godkendt medicinsk behandling til at målrette iskæmisk slagtilfælde. Aktuel forskning inden for iskæmisk slagtilfælde fokuserer på bedre forståelse Patofysiologi af slagtilfælde, at udvikle og undersøge roman farmaceutiske mål. Pålidelige eksperimentelle slagtilfælde modeller er afgørende for udviklingen af mulige behandlinger. Den midterste cerebral arterie okklusion (MCAO) model er klinisk relevant og de hyppigst anvendte kirurgisk model af iskæmisk slagtilfælde i gnavere. Resultaterne af denne model, som læsion volumen, er dog forbundet med en høj grad af variabilitet, især i mus. Den alternative MCAO model beskrevet her tillader reperfusion af den fælles halspulsåren (CCA) og den øgede perfusion af den midterste cerebral arterien (MCA) område, ved hjælp af en væv pad med fibrinogen-baserede fugemasse til at reparere fartøjet, og den forbedrede velfærd i mus ved at undgå eksterne halspulsåren (ECA) ligatur. Dette reducerer afhængigheden af kredsen af Willis, som er kendt for at være yderst anatomisk variabel i mus. Repræsentative data viser, at bruge denne alternative kirurgisk tilgang falder variabilitet i læsion mængder mellem de traditionelle MCAO tilgang og den alternative fremgangsmåde beskrevet her.
En væsentlig årsag til cerebral apopleksi er fokal iskæmi i området af den midterste cerebral arterie. Væv plasminogen aktivator (tPA) er det kun farmakologiske behandling med dokumenteret effekt, på trods af talrige kliniske lægemiddelforsøg målrettet til iskæmisk slagtilfælde1,2. Men på grund af sikkerhedsproblemer og et smalt terapeutisk vindue (< 4,5 h), kun ~ 15% af alle slagtilfælde patienter er berettiget til at modtage tPA, og recanalization priser kan være < 50%3,4.
Reproducerbare og klinisk relevante dyremodeller for slagtilfælde betragtes som væsentlige at informere udviklingen af nye og potentielle slagtilfælde terapeutiske behandlinger. På grund af bekymringer vedrørende konsistens og variation i resultaterne med dyremodeller er det imidlertid vigtigt at forfine eksisterende i vivo modeller for at forbedre oversættelse fra prækliniske undersøgelser til klinikken. Manglen oversættelse fra prækliniske eksperimentelle effekten af potentielle behandlinger til klinisk brug er en fortsat bekymring for slagtilfælde forskning5. Årsager til manglende oversættelse er tilbøjelige til at være flere og kan være relateret til for eksempel forsøgsdesign, behandling forsinkelser, kliniske slagtilfælde heterogenitet, og begrænsninger af de dyremodeller bruges6. En central udfordring for slagtilfælde forskning er fortsat udvikling af sikre og effektive behandlinger.
Midterste cerebral arterieokklusion (MCAO) af intraluminal glødetrådens indsættelse er den hyppigst anvendte i vivo gnaver model af eksperimentelle slagtilfælde. Denne model giver mulighed for restaurering af blodgennemstrømningen efter en iskæmi induktion, efterligne hændelser, som forekommer i menneskelige slagtilfælde7. Dog ske især i mus, heterogene læsion diskenheder med varieret standardafvigelser selvom defineret kirurgisk protokoller er anvendt8,9,10. Det er typisk at se en bimodal fordeling af små striatal og store striato-kortikale læsion bind11. For at fremkalde iskæmi, er glødetråden typisk indsættes gennem et snit i CCA eller ECA, der forbliver permanent sammenskrevne12. Den permanente ligatur af CCA forhindrer genoprettelsen af blodgennemstrømningen i den interne halspulsåren (ICA) og efterfølgende MCA område. Dette forårsager reperfusion at være afhængige af den sikkerhedsstillelse levering inden for kredsen af Willis (ko). Ko struktur har anatomiske variabiliteten mellem enkelte dyr, især i C57BL/6 mus-en stamme bruges typisk i i vivo slagtilfælde forskning13. En alternativ metode, af glødetrådens isætning gennem Revisionsretten, tillader den fortsatte perfusion gennem CCA, men denne metode kompromiser den arterielle forsyning ECA-område, som har været vist i rotter, at have en skadelig virkning på dyrets velvære14.
Afhængigheden af ko for sikkerhedsstillelse forsyning og reperfusion i den etablerede MCAO model kan delvis højde for læsion volumen variabilitet efter okklusion. Vi beskriver en alternative murine kirurgisk procedure, hvor Revisionsretten ligatur undgås og CCA indsnit er repareret, således tillader reperfusion gennem CCA, uafhængig af koen. Reparation af CCA snit har tidligere vist i rotter at resultere i en vellykket reperfusion gennem CCA15. Vi har anvendt denne fremgangsmåde med succes i mus11 og rapportere her den protokol, som resulterer i en reduceret variation i læsion volumen, Hovedresultatet måleenhed i eksperimentel slagtilfælde undersøgelser.
I denne protokol vise vi hvordan du kan foretage MCAO gennem CCA fartøj glødetrådens indsættelse efterfulgt af CCA fartøj reparation, som indebærer en væv pad og fugemasse ansøgning tillade reperfusion.
Glødetrådens induktion af forbigående MCAO i gnavere er den hyppigst anvendte eksperimentelle slagtilfælde model, da det giver mulighed for reperfusion til det ramte område, efterligne forekomsten af begivenhederne efter klinisk iskæmisk slagtilfælde7. Rapporteret her er en alternativ kirurgisk tilgang til den traditionelle metode med glødetråd-induceret forbigående MCAO i mus. Den alternative tilgang, der involverer analgesi behandling, ECA ligatur undgåelse og CCA indsnit reparation, resulterer i en reduceret LV variabilitet når vurderet ved hjælp af både Mr og histologiske farvning metoder11.
Traditionelle metoder til at fremkalde MCAO i høj grad stole på transection, eller på mindst ligatur af Revisionsretten, som har været vist i rotter, at påvirke drikkevaner og en stigning i kroppen vægttab efter MCAO14. Den protokol, der er defineret her, i mus, med undgåelse af ECA ligatur og analgesi tilsætning, foreslog en reduktion i kroppen vægttab efter MCAO med ingen effekt på læsion volumen. Brugen af smertestillende midler er undgået, eller i det mindste ikke rapporteret i størstedelen af eksperimentelle slagtilfælde undersøgelser, på grund af mulige forstyrrende virkninger på det eksperimentelle resultat. Men undgå analgesi helt er ikke altid begrundet og der er behov for at skabe balance mellem dyrenes velfærd behov med de videnskabelige mål.
Forskelle i dyrenes størrelse, stamme og cerebrovaskulær anatomi, ud over glødetråden størrelse og type variationer, er alle foreslået for at påvirke slagtilfælde resultater23,24. Den alternative metode beskrevet her undgår afhængigheden af koen under reperfusion, dermed reducere, i det mindste i en del, variabiliteten set mellem dyr i læsion volumen. Ko anatomi er meget varierende i mus, navnlig i C57BL /6 stamme, som ofte bruges i eksperimentel slagtilfælde undersøgelser. 90% af C57BL/6 mus har en ufuldstændig ko på grund af et varieret posteriore kommunikere arterie (PcomA) passage, som kan have en effekt på omfanget af iskæmisk skade på grund af den utilstrækkelige perfusion af strukturer uden for MCA område13, 25. reparation CCA i mus, som vist her, resultater i genindførelsen af blod flyde via CCA til iskæmisk område, som tidligere beskrevet i rotter15. De repræsentative data viser, at reparation af CCA øger reperfusion, selvom blodgennemstrømningen i CCA ikke var direkte måles. Det er dog muligt for kirurgen at visualisere CCA reperfuse med blod efter reparation fartøj, som det vender tilbage til en pulserende og fuld tilstand hele stammen, proksimale og distale til reparation placering. Denne visuel bekræftelse, sammen med laser Doppler flowmetry aflæsninger af området iskæmisk kan bruges til at bekræfte den vellykket reparation af fartøjet. Tiden mellem væv pad anbringelse og fjernelse af fartøj klip fra CCA kan indvirke på den deraf følgende passage af CCA, som at reducere tiden mellem væv pad ansøgning og klip fjernelse vil forhindre væv pad i fastholdelsen af o pposite side af CCA. Selv om teknisk udfordrende, kræver den alternative MCAO procedure forklares her ikke nogen yderligere kvalifikationer end dem, der kræves for at udføre kirurgisk induktion af MCAO i mus.
Traditionelt forbindes med en høj variabilitet i statusmålinger, kan eksperimentelle slagtilfælde undersøgelser have en tendens til at være underdimensioneret. Etik og velfærd krav i kombination med økonomiske og praktiske bekymringer kan bidrage til undersøgelser er underdimensioneret. Ved at reducere variabiliteten i resultatet, og derfor producerer mere ensartet læsion resultater på tværs af en eksperimentel musikgruppe, kan mere effektiv power beregninger udføres med det endemål at undersøgelser at være passende drevet.
Afslutningsvis, dette alternativ CCA reparationsprocedure, i mus, resulterer i mindre variation i læsion volumen efter eksperimentel slagtilfælde og giver mindre eksperimentelle grupper at være forpligtet til at teste en behandling virkning når passende magt beregninger der bruges.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Centre for udskiftning, raffinement og reduktion af dyr i forskning (NC3Rs; NC/M000117/1 til CG). Forfatterne takke personalet i afdelingen for biomedicinsk Services, University of Leicester, for deres pleje af forsøgsdyr og Maria Viskaduraki for hendes statistisk rådgivning. De repræsentative resultater er tilpasset med tilladelse fra sygdomsmodeller & mekanismer11.
0.7mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight – use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2ml |
Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel – manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx – rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
sterile petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50mm sterile petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50mm diameter is required. |
Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |