Intraluminal glödtråden ocklusion av den mellersta cerebral artären är den vanligaste in-vivo -modellen för experimentell stroke hos gnagare. En alternativ kirurgisk metod att låta gemensamma halspulsådern reparation utförs här, vilket gör att reperfusion av den gemensamma halspulsådern och en full reperfusion mellersta cerebral artär territorium.
Ischemisk stroke är en viktig orsak till vuxen långsiktiga invaliditets- och dödsfallsersättning i hela världen. De nuvarande behandlingarna som är tillgängliga är begränsade, med endast vävnad plasminogen activator (tPA) som godkända läkemedelsbehandling att rikta ischemisk stroke. Aktuell forskning inom området för ischemisk stroke fokuserar på att bättre förstå patofysiologin av stroke, att utveckla och undersöka nya farmaceutiska mål. Pålitlig experimentell stroke modeller är avgörande för utvecklingen av potentiella behandlingar. Den mellersta cerebral artär ocklusion (MCAO) modellen är kliniskt relevant och till de vanligaste kirurgiska modell av ischemisk stroke hos gnagare. Resultaten av denna modell, såsom lesion volym, är dock associerade med höga nivåer av variabilitet, särskilt hos möss. Den alternativa MCAO modellen beskrivs här tillåter reperfusion av den gemensamma halspulsådern (CCA) och ökad perfusionen i mellersta cerebral artär (MCA) territorium, med en vävnad pad med fibrinogen-baserade tätningsmedel för att reparera fartyget och den förbättrade välfärd för mössen genom att undvika yttre halspulsådern (ECA) ligatur. Detta minskar beroendet av Circle of Willis, som är kända för att vara mycket anatomiskt variabel hos möss. Representativa uppgifter visar att använda detta alternativ kirurgisk metod minskar variabiliteten i lesionen volymer mellan den traditionella MCAO-metoden och det alternativa tillvägagångssättet som beskrivs här.
En viktig orsak till cerebral stroke är fokal ischemi i territorium av den mellersta cerebral artären. Tissue plasminogen activator (tPA) är endast farmakologisk behandling med bevisad effekt, trots många kliniska läkemedelsprövningar riktade till ischemisk stroke1,2. Men på grund av oro för säkerheten och ett smalt terapeutiskt fönster (< 4,5 h), endast ~ 15% av alla strokepatienter är berättigade till tPA och recanalization kan vara < 50%3,4.
Reproducerbar och kliniskt relevanta djurmodeller av stroke anses viktigt att informera utvecklingen av nya och potentiella stroke terapeutiska behandlingar. Dock på grund av oro för konsekvens och variabilitet i utfallen med djurmodeller, det är fortfarande viktigt att förfina befintliga in-vivo -modeller för att förbättra översättningen från prekliniska studier till kliniken. Bristen på översättning från prekliniska experimentella effekten av potentiella behandlingar till klinisk användning är en pågående oro för stroke forskning5. Felorsakerna översättning kan vara flera och kan relateras till, exempelvis rättegång design, behandling förseningar, kliniska stroke heterogenitet, och begränsningarna av djurmodeller används6. En viktig utmaning för stroke forskning fortfarande utvecklingen av säkra och effektiva behandlingar.
Mellersta cerebral artärocklusion (MCAO) av intraluminal glödtråden införande är den vanligaste i vivo gnagare modellen av experimentell stroke. Denna modell tillåter återställande av blodflödet efter en ischemi induktion, härma de händelser som inträffar i mänskliga stroke7. Men uppstå i synnerhet hos möss, heterogena lesion volymer med varierad standardavvikelser även om definieras kirurgiska protokoll är tillämpad8,9,10. Det är typiskt att se en bimodal fördelning av små striatum och stora striato-kortikala lesion volymer11. För att inducera ischemi, sätts glödtråden oftast genom ett snitt av CCA eller revisionsrätten som sedan förbli permanent sammanskrivna12. Den permanenta ligering av CCA förhindrar ren-establishment av blodflödet i den inre halspulsådern (ICA) och därefter MCA territorium. Detta orsakar reperfusion vara beroende av säkerheter leverans inom den Circle of Willis (Ko). Den ko strukturen har anatomiska variationer mellan enskilda djur, särskilt i C57BL/6 möss-en stam används vanligtvis i vivo stroke forskning13. En alternativ metod, att glödtråden införande genom revisionsrätten, tillåter fortsatt perfusionen genom CCA, men denna metod kompromisser den arteriella försörjningen till ECA territorium, som har visat, råttor, att ha en skadlig effekt på djurets välbefinnande14.
Beroendet av kon säkerheter leverans och reperfusion i etablerade MCAO modellen kan delvis står för lesionen volym variabiliteten efter ocklusion. Vi beskriver en alternativ murina kirurgisk procedur där revisionsrätten ligering undviks och CCA snittet repareras, således tillåter reperfusion genom CCA, oberoende av ko. Reparation av CCA snittet har visats tidigare i råttor att resultera i en framgångsrik reperfusion genom de CCA15. Vi har tillämpat denna metod framgångsrikt i möss11 och rapportera här protokollet vilket resulterar i en minskad variabilitet i lesionen volym, viktigaste resultatet måttenheten i experimentell stroke studier.
I detta protokoll visar vi hur du genomför MCAO genom CCA fartyget glödtråden införande följt av CCA fartyget reparation, vilket innebär en vävnad pad och tätningsmedel för att tillåta reperfusion.
Glödtråden induktion av övergående MCAO hos gnagare är mest använda experimentell stroke modell, eftersom det tillåter reperfusion till det drabbade området, härma inträffar efter kliniska ischemisk stroke7. Redovisas här är ett kirurgiskt alternativ till den traditionella metoden att glödtråden-inducerad övergående MCAO i möss. Det alternativa tillvägagångssättet, som inbegriper analgesi behandling, ECA ligering undvikande och CCA snitt reparation, resulterar i en minskad LV variabilitet när utvärderas med hjälp av både MRT och histologiska färgning metoder11.
Traditionella metoder att framkalla MCAO i hög grad förlita sig på transection eller på minst ligatur, från revisionsrätten, som har visats, råttor, påverka dryckesbeteende och en ökning av viktminskning efter den MCAO14. Det protokoll som definieras här, i möss, med undvikande av ECA ligering och analgesi tillägg, föreslog en minskning av viktminskning efter MCAO med ingen effekt på volymen lesion. Användning av analgesi undviks, eller åtminstone inte rapporterats, i majoriteten av experimentell stroke studier, på grund av möjliga störande effekter på den experimentella resultaten. Dock undvika analgesi helt är inte alltid motiverat och det finns ett behov att balansera behovet av välfärd för djuren med uppnåendet av de vetenskapliga mål.
Skillnader i djurens storlek, stam och cerebrovaskulär anatomi, förutom glödtråden storlek och typ variationer, är alla föreslagna för att påverka stroke resultat23,24. Det alternativa tillvägagångssättet som beskrivs här undviker beroendet kon under reperfusion, vilket minskar, åtminstone delvis, variabiliteten sett mellan djur i lesionen volym. CoW anatomi är mycket varierande i möss, i synnerhet i C57BL /6 stam, som ofta används i experimentell stroke studier. 90% av C57BL/6 möss har en ofullständig ko på grund av en varierad bakre kommunicerande artären (PcomA) patency, som kan ha en effekt på volymen av ischemisk skada på grund av otillräcklig perfusionen av strukturer utanför den MCA territorium13, 25. reparation CCA i möss, som visas här, resultat i ren-establishment av blod flöde via CCA till det ischemiska området, som tidigare beskrivits i råttor15. De representativa uppgifterna här visar att reparation av CCA ökar reperfusion, även om blodflödet i CCA inte mättes direkt. Det är dock möjligt för kirurgen att visualisera den CCA reperfuse med blod efter fartyget reparation, som returneras till ett pulserande och full tillstånd längs stammen, proximala och distala till platsen för reparation. Här visuell bekräftelse, tillsammans med laser Doppler flowmetry avläsningar av det ischemiska området, kan användas för att bekräfta lyckad reparation av fartyget. Tiden mellan programmet vävnad pad och avlägsnande av fartyget klippet från CCA kan ha en inverkan på den resulterande patency av CCA, som att minska tiden mellan programmet vävnad pad och klipp bort förhindrar vävnad pad klibba till o pposite sida av CCA. Även om tekniskt utmanande, kräver den alternativa MCAO proceduren förklaras här inte någon ytterligare kompetens än de som krävs för att utföra kirurgiska induktion av MCAO hos möss.
Traditionellt förknippas med en hög variation i resultatåtgärder, kan experimentell stroke studier ha en tendens att vara underdimensionerad. Etik- och djurskyddsfrågor krav i kombination med ekonomiska och praktiska oro kan bidra till studier varelse underpowered. Genom att minska variabiliteten i resultatet, och därför producerar mer konsekvent lesion resultat över en experimentell grupp, kan effektivare power beräkningar utföras med det yttersta målet med studierna på lämpligt sätt ström.
Sammanfattningsvis, alternativa CCA reparationsproceduren, i möss, resulterar i mindre variabilitet i lesionen volym efter experimentell stroke och möjliggör mindre experimentella grupper krävs för att testa en behandlingseffekt när lämpliga power beräkningar används.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av nationellt centrum för ersättning, förfining och minskning av djur i forskningen (NC3Rs; NC/M000117/1 till CG). Författarna tacka personalen Division av biomedicinska tjänsterna, universitetet i Leicester, för deras vård av försöksdjur och Maria Viskaduraki för hennes statistiska råd. De representativa resultat är anpassade med tillstånd från Disease Models & mekanismer11.
0.7mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight – use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2ml |
Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel – manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx – rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
sterile petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50mm sterile petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50mm diameter is required. |
Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |