Digital Polymerasekædereaktionen (PCR) er et nyttigt redskab til høj følsomhed påvisning af enkelt nucleotid varianter og DNA kopi antal varianter. Her, viser vi centrale overvejelser i forbindelse med måling af sjældne varianter i det menneskelige genom ved hjælp af digital PCR med formatet chip i rør.
Kvantitativ analyse af menneskers genetiske variation er afgørende for at forstå de molekylære karakteristika af alvorlige medicinske tilstande, såsom tumorer. Fordi digital polymerase kædereaktion (PCR) aktiverer en præcis kvantificering af DNA kopi antal varianter, bliver de et vigtigt værktøj til påvisning af sjældne genetiske variationer, som resistente mutationer. Det forventes at molekylære diagnoser ved hjælp af digital PCR (dPCR) vil være tilgængelig i klinisk praksis i den nærmeste fremtid; således, hvordan man effektivt fører dPCR med menneskets genetiske materiale er et varmt emne. Her, indfører vi en metode til at registrere adenomatøs polypose coli (APC) somatiske mosaicisme ved hjælp af dPCR med formatet chip i rør, som giver mulighed for otte dPCR reaktioner skal gennemføres samtidigt. Bør udvises forsigtighed ved fylde- og forseglingmaskiner reaktionsblandingen på chips. Denne artikel viser, hvordan man undgår over- og undervurdering af positive partitioner. Desuden præsenterer vi en enkel procedure for indsamling dPCR produkt fra partitioner på de chips, som derefter kan bruges til at bekræfte den særlige forstærkning. Vi håber, at denne metoder betænkning vil bidrage til at fremme dPCR med metoden chip i rør i genetisk forskning.
Kvantitativ PCR (qPCR) er ofte bruges til at kvantificere menneskelige genetiske variation, herunder enkelt nucleotid varianter (SNVs) og DNA kopi nummer variationer (CNVs). I qPCR, en polymerase reaktion er udført i hver tube på samme måde som de konventionelle end-point PCR, og en forstærkning signal er erhvervet fra røret efter hver varmecyklus. Derimod i dPCR, hvilket betyder end-point dPCR i denne rapport, PCR-blandingen er indlæst i mange mikroskopiske kamre, kaldes partitioner, hvor DNA-skabeloner er til stede eller fraværende på en begrænsende fortynding og hver partition, der indeholder PCR-blandingen er vurderet som negativ eller positiv efter komplet PCR. Mens det er let at vurdere, at der er ingen DNA skabeloner i de negative partitioner, er det uklart hvor mange kopier af DNA skabeloner er til stede i de positive partitioner. Derfor skønnes antallet af DNA skabeloner i de positive partitioner baseret på Poisson-fordelingen, ved hjælp af Grev fra negative partitioner1. dPCR er dyrere og har en mindre dynamikområde i forhold til qPCR, men denne metode giver mulighed for en absolut kvantificering og tilbyder en højere følsomhed og større præcision2.
En af de vigtigste anvendelser af dPCR er en validering af de varianter, der er identificeret af næste generation sequencing (NGS). Især ved sjældne varianter, betyder lav variant fraktioner, er validering afgørende på grund af sekventering fejl, der kan opstå i NGS3. Mens Sanger sekvensering og qPCR er nyttige værktøjer til validering af SNVs og CNVs, deres følsomhed er lav i forhold til dPCR. Derfor er dPCR teknologien i efterspørgslen efter genetiske undersøgelser beskæftiger sig med sjældne varianter. For nylig, påvisning af flydende biopsi af sjældne varianter relateret til kræft egenskaber, herunder resistens, er blevet et varmt emne i molekylær diagnostik og terapi4. DPCR teknologi synes velegnet til flydende biopsi undersøgelser og forventes at have vigtige kliniske applikationer i den nærmeste fremtid selv om forbedringer vedrører den dynamikområde og omkostningerne er stadig forpligtet til at blive gennemført.
Kommercielt tilgængelige dPCR teknologi kan groft inddeles i droplet- og chip-baserede platforme; forskellen er, hvordan DNA-skabeloner er partitioneret5,6,7. I dPCR med chip i rør format fordeles PCR-blandingen af kapillaritet i partitioner på en chip. Chipsene er bygget i otte-tube strips, som mange lab personale vil allerede være bekendt med, og således otte prøver kan behandles på én gang8. I læsning trin tager det < 1 h at behandle 96 prøver ved at afsløre hele billedet af chip og ikke hver partition. Da dPCR med formatet chip i rør har en høj produktivitet sammenlignet med andre dPCR systemer, er brugervenlighed og produktivitet de vigtigste fordele for sine brugere.
I denne betænkning, somatiske mosaicisme af APC -genet hos en patient med sporadiske familiær adenomatøs polypose er brugt som en repræsentant og resultaterne af dPCR og NGS sammenlignes. Hovedformålet med denne betænkning er at klart kvantificere en enkelt nukleotid variant bruger dPCR med formatet chip i rør. Vi håber, at denne rapport er nyttig for forskere interesseret i at vedtage dPCR platform for deres eget arbejde.
DIN værdi er ofte bruges til at vurdere beskadigede DNA (fx, gDNA fra formalin-fast paraffin-embedded væv) før kvantificering eller sekventering, fordi en avanceret nedbrydning af gDNA kan resultere i lav kvalitet data. DIN vurdering bliver således et vigtigt skridt i kvalitetskontrol af menneskelige gDNA11. Da gDNA anvendes i de repræsentative eksperiment havde været gemt ved 4 ° C for 4-11 år efter dens udvinding fra blod, blev DIN værdier bestemt for en kvalitetskontrol inden dPCR assay. Dette trin anbefales, især hvis materialerne, der er mistænkt for at være beskadiget. Koncentrationen af gDNA var endvidere bestemmes ved elektroforese. Fordi det dynamiske område af dPCR ikke er så bred som for qPCR på grund af begrænsninger af partitionerne, er en måling af gDNA koncentration et vigtigt skridt til et vellykket dPCR assay. Da mængden af input DNA var korreleret med den samlede kopi antal variant og reference alleler i dPCR assay (R-kvadreret = 0.935; Tabel 4), elektroforese er nyttige til måling af gDNA koncentration før dPCR assay.
Påfyldning og forsegling processer er vigtige skridt for succesfulde resultater. Det er afgørende at bekræfte den passende montering af PCR-blandingen på platformen og sikre kontakt mellem chip og platform (fig. 1A). Fremspring i PCR blanding fra skyderen kan forårsage ugyldig distribution på chip. Bekræfter fordelingen af positive og negative partitioner på en position plot er også nødvendige for en præcis analyse, fordi det antages i Poisson statistikker, at DNA skabeloner tilfældigt er opdelt i afdelinger1. I de repræsentative resultater, blev positive partitioner fordelt i hele chip (figur 3). Dette resultat opfylder kravet for Poisson statistikker og afspejler, at påfyldning og forsegling procedurer var effektiv. Når du rør i den forsegling enhancer, chipsene kunne brydes, hvis den centrale del af det øverste låg er skubbet kraftigt (figur 1B). For at undgå dette, forsigtigt skubbe kanten af det øverste låg. Hvis der er en kunstig klynge af positive partitioner (fig. 1D), kan eksemplarnummer overvurderes som følge af en krydskontaminering mellem partitioner. Forsegling proceduren bør forbedres, hvis en pøl af væsken er synlige på overfladen (figur 1C) (f.eks.ved at køre sekventielt den forsegling enhancer for 1 min). Hvis der er en ujævn fordeling af positive partitioner (figur 1E), kan være undervurderet kopi nummer på grund af utilstrækkelig forstærkning eller forurening af forsegling væske og vand. PCR betingelser bør justeres i dette tilfælde [f.eks.ved tuning temperaturen eller varigheden af PCR (trin 3.11 i protokollen) eller ved at sikre, at den forsegling væske og vand hældes i jig er ren]. Fluorescens signaler registreres fra 8-tube strip nedsænket i destilleret vand. Hvis luftbobler overholder tube overflade, er der mulighed for, at de kan forstyrre signal detektion (figur 1F). Bobler bør derfor ryddes ved hjælp af et værktøj, som et fint pipette tip. Derudover kan luftbobler danne inde i rørene, når de angives i jig (figur 1G). Hvis bobler inde i rørene er stor nok til at dække chippen, bør de også ryddes. Boblerne kan klare hvis de efterlades i flere minutter ved stuetemperatur.
Nogle positive partitioner kan blive opdaget i NTC. For at undgå en kontaminering af DNA skabeloner, holde bænken ren, og hvis det er muligt, gøre en rene rum med en fan filterenhed. Hvis er mistanke om en kontaminering af DNA skabeloner, grundigt rense rummet og/eller kassere de anvendte reagenser. Derimod, hvis de positive partitioner af reference-allelen ikke registreres i nærværelse af gDNA, bekræfte koncentrationer af gDNA, primere og sonder. Især, blev primere brugt ved en lavere koncentration i de repræsentative eksperiment, i forhold til konventionelle PCR (tabel 1)12. Det er også afgørende at bekræfte den rampe sats, hvilket er sjældent ændres i konventionelle PCR.
Hvad gør dPCR med formatet chip i rør unikke er partitionering af PCR-blandingen inde universal 8-tube strip8,13. En overførsel af afskærmning afdelinger ind i et PCR rør er ikke påkrævet i dette system, dermed reducere risikoen for forurening. Der er også en fordel i dPCR systemet med chip i rør format; det tager < 4 h at afslutte 96 assays i dPCR systemet, mens det tager mindst 5 h at afslutte det samme antal assays i droplet-baserede dPCR14. Desuden, den universelle 8-tube strip muliggør brug af en konventionel termisk cycler, i modsætning til en anden chip-baserede dPCR15, som kræver en termisk cycler med en flad blok. Også, den akkumulerede viden og reagenser til konventionelle PCR kan anvendes til dPCR systemet. Dette vil være nyttigt for at udvide anvendelserne af dPCR.
Det skal bemærkes, at dPCR har flere begrænsninger. I dPCR med formatet chip i rør er partitionsnummeret på chippen relativt lav sammenlignet med dem i andre dPCR platforme. Yderligere forbedring af chip-enhed vil være forpligtet til at øge det dynamiske område, der afhænger af antallet af partitioner. Fordi de indre rum af den universelle tube er begrænset, er en banebrydende design for chip-enhed forpligtet til at øge antallet af partitioner. Automatisering af proceduren for hele dPCR i fremtiden ville reducere human fejl, hvilket resulterer i endnu mere pålidelige resultater. På grund af dens høj overførselshastighed og høj følsomhed natur forventes dPCR med chip i rør format skal anvendes for at behandle et stort antal prøver til flydende biopsier og miljømæssige DNA.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af en licensbetaling for Scientific Research (C) fra Japan samfundet for fremme videnskab (JSP’ER) (nr. 15 K 08397) til Tomoaki Kahyo, og ved tilskud fra Japan Agency for medicinalforskning og udvikling (AMED) (nr. 927960719), Licensbetaling for sonderende forskning (nr. 16K 15256), udgifter til tilknyttede projekter af en ansporende særlige Budget til fremme af en National University Reform Management udgifter tilskud (nr. 1019253), og rygning Research Foundation at Haruhiko Sugimura. Forfatterne takke Dr. Iwaizumi og Dr. Kurachi for deres kliniske støtte. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i udarbejdelsen af manuskriptet. Figur 3, figur 4og tabel 4 er tilpasset og Genoptrykt fra en artikel af Kahyo et al. 10, med tilladelse fra Elsevier.
QIAamp DNA Blood Maxi Kit | Qiagen | 51194 | Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA |
NanoDrop 1000 | ThermoFisher SCIENTIFIC | ND-8000 | Before Protocol 1: Spectrophotometer |
8-strip tube | Agilent Technologies | 401428 | Protocol 1 |
Genomic DNA sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay |
DNA ladder | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay |
MS3 Basic Small Shaker | IKA | 3617000 | Protocol 1: Vortex mixer |
Genomic DNA ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5365 | Protocol 1: Gel device |
2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2965AA | Protocol 1: Electrophoresis instrument |
TapeStation Analysis Software | Agilent Technologies | Bundled with G2965AA | Protocol 1: Analysis software |
DNA oligo primers | IDT | Custom order | Protocol 2 |
LNA probes | IDT | Custom order | Protocol 2 |
Software tool | IDT | Web site: http://biophysics.idtdna.com/ | Protocol 2 |
dbSNP database | NCBI | Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ | Protocol 2 |
TE buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12090015 | Protocol 3 |
DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher SCIENTIFIC | 10977015 | Protocol 3 (Table 1) |
Clarity Digital PCR Probe Mastermix | JN Medsys | 12013 | Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix A component of #10011 |
Clarity Sealing Fluid | JN Medsys | 12005 | Protocol 3: Sealing fluid A component of #10011 |
Clarity JN Solution | JN Medsys | 12006 | Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution A component of #10011 |
Clarity Tube-strip | JN Medsys | 12007 | Protocol 3: Chip-in-a-tube A component of #10011 |
Clarity Sample Loading Kit | JN Medsys | 12008 | Protocol 3: Loading platform and slider A component of #10011 |
Clarity Auto Loader | JN Medsys | 11002 | Protocol 3: Auto loader A component of #10001 |
Clarity Sealing Enhancer | JN Medsys | 11003 | Protocol 3: Sealing enhancer A component of #10001 |
Clarity Reader | JN Medsys | 11004 | Protocol 3: Reader A component of #10001 |
Life Eco Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | Protocol 3: Thermal cycler |
Clarity Software | JN Medsys | Bundled with #10001 | Protocol 3: Analysis software |
High Sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | Protocol 4: Gel device for high sensitivity |