डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) सिंगल न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट और डीएनए कॉपी नंबर वेरिएंट की उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए एक उपयोगी उपकरण है । यहां, हम मानव जीनोम में दुर्लभ वेरिएंट चिप में एक ट्यूब प्रारूप के साथ डिजिटल पीसीआर का उपयोग मापने के लिए महत्वपूर्ण बातों का प्रदर्शन ।
मानव आनुवंशिक भिंनता का मात्रात्मक विश्लेषण गंभीर चिकित्सा शर्तों, जैसे ट्यूमर के आणविक विशेषताओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । क्योंकि डिजिटल पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रियाओं (पीसीआर) डीएनए कॉपी संख्या वेरिएंट के सटीक ठहराव सक्षम, वे दुर्लभ आनुवंशिक रूपों का पता लगाने के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन रहे हैं, ऐसे दवा प्रतिरोधी उत्परिवर्तनों के रूप में । यह उम्मीद है कि आणविक निदान डिजिटल पीसीआर (dPCR) का उपयोग निकट भविष्य में नैदानिक अभ्यास में उपलब्ध हो जाएगा; इस प्रकार, कैसे कुशलतापूर्वक मानव आनुवंशिक सामग्री के साथ dPCR आचरण के लिए एक गर्म विषय है । यहां, हम एक विधि परिचय एडिनोमेटस पोलीपोसिस कोलाई (APC) दैहिक मोज़ेक चिप के साथ dPCR का उपयोग कर का पता लगाने में एक ट्यूब प्रारूप है, जो आठ dPCR प्रतिक्रियाओं को एक साथ आयोजित होने की अनुमति देता है । देखभाल जब भरने और चिप्स पर प्रतिक्रिया मिश्रण सील लिया जाना चाहिए । यह आलेख प्रदर्शित करता है कि कैसे से बचने के लिए और अधिक सकारात्मक विभाजन के अनुमान । इसके अलावा, हम चिप्स, जो तब विशिष्ट प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर विभाजन से dPCR उत्पाद इकट्ठा करने के लिए एक सरल प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । हमें उंमीद है कि इस तरीकों की रिपोर्ट में मदद मिलेगी चिप के साथ dPCR को बढ़ावा देने में एक आनुवंशिक अनुसंधान में ट्यूब विधि ।
मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) अक्सर एक न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट (SNVs) और डीएनए की नकल संख्या रूपांतरों (CNVs) सहित मानव आनुवंशिक भिन्नता, यों तो इस्तेमाल किया जाता है. qPCR में, एक पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया पारंपरिक अंत बिंदु पीसीआर में उसी तरह के रूप में एक ट्यूब में किया जाता है, और एक प्रवर्धन संकेत हर थर्मल चक्र के बाद ट्यूब से हासिल की है । इसके विपरीत, dPCR में, अर्थ अंत बिंदु dPCR इस रिपोर्ट में, पीसीआर मिश्रण कई सूक्ष्म कक्षों में भरी हुई है, कार्यकाल विभाजन, जहां डीएनए टेम्पलेट्स मौजूद हैं या एक सीमित कमजोर पड़ने पर अनुपस्थित, और हर विभाजन पीसीआर मिश्रण युक्त के रूप में मूल्यांकन किया गया है पूरी पीसीआर के बाद निगेटिव या पॉजिटिव । हालांकि यह अनुमान लगाना आसान है कि नकारात्मक विभाजन में कोई डीएनए टेम्पलेट्स नहीं हैं, यह स्पष्ट नहीं है कि डीएनए टेम्पलेट्स की कितनी प्रतियां सकारात्मक विभाजन में मौजूद हैं. इसलिए, सकारात्मक विभाजन में डीएनए टेम्पलेट्स की संख्या Poisson वितरण के आधार पर अनुमानित है, जो ऋणात्मक विभाजन1से गणना का उपयोग कर रहा है. dPCR अधिक महंगा है और qPCR की तुलना में एक छोटे गतिशील रेंज है, लेकिन इस विधि एक निरपेक्ष ठहराव सक्षम बनाता है और एक उच्च संवेदनशीलता और अधिक से अधिक सटीक2प्रदान करता है ।
dPCR के मुख्य अनुप्रयोगों में से एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) द्वारा की पहचान की वेरिएंट के सत्यापन है । विशेष रूप से दुर्लभ वेरिएंट के मामले में, कम भिन्नता भिन्न अर्थ, सत्यापन NGS3में हो सकता है कि sequencing त्रुटियों के कारण महत्वपूर्ण है. जबकि सैंज अनुक्रमण और qPCR SNVs और CNVs के सत्यापन के लिए उपयोगी उपकरण हैं, उनकी संवेदनशीलता dPCR की तुलना में कम है । इसलिए, dPCR प्रौद्योगिकी आनुवंशिक अध्ययन के लिए दुर्लभ वेरिएंट से निपटने की मांग में है । हाल ही में, इस तरह के दवा प्रतिरोध के रूप में कैंसर विशेषताओं से संबंधित दुर्लभ वेरिएंट के तरल बायोप्सी द्वारा पता लगाने, आणविक निदान और4चिकित्सा में एक गर्म विषय बन गया है । dPCR प्रौद्योगिकी तरल बायोप्सी अध्ययन के लिए उपयुक्त प्रतीत होता है और निकट भविष्य में महत्वपूर्ण नैदानिक अनुप्रयोगों की उंमीद है, हालांकि गतिशील रेंज और लागत से संबंधित सुधार अभी भी लागू किया जाना चाहिए ।
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध dPCR प्रौद्योगिकी मोटे तौर पर छोटी बूंद-आधारित और चिप आधारित प्लेटफार्मों में वर्गीकृत किया जा सकता है; अंतर यह है कि कैसे डीएनए टेम्पलेट्स5,6,7विभाजित कर रहे हैं. चिप में एक ट्यूब प्रारूप के साथ dPCR में, पीसीआर मिश्रण एक चिप पर विभाजन में केशिका कार्रवाई के द्वारा वितरित किया जाता है । चिप्स आठ में निर्मित कर रहे है ट्यूब स्ट्रिप्स, जो कई लैब स्टाफ के साथ पहले से ही परिचित हो जाएगा, और, इस प्रकार, आठ नमूने एक समय8में इलाज किया जा सकता है । पठन चरण में, चिप की पूरी छवि का पता लगाने और प्रत्येक पार्टीशन नहीं होने से ९६ नमूनों का उपचार करने के लिए < 1 h लगता है । चिप के साथ dPCR के बाद से एक ट्यूब प्रारूप में एक उच्च प्रवाह है अंय dPCR प्रणालियों, प्रयोज्य और उत्पादकता के साथ तुलना में अपने उपयोगकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण लाभ हैं ।
इस रिपोर्ट में, एक रोगी में छिटपुट पारिवारिक एडिनोमेटस पोलीपोसिस के साथ APC जीन की दैहिक मोज़ेक एक प्रतिनिधि मामले के रूप में प्रयोग किया जाता है और dPCR और NGS के परिणाम की तुलना कर रहे हैं । इस रिपोर्ट का मुख्य उद्देश्य स्पष्ट रूप से एक एकल न्यूक्लियोटाइड चिप के साथ dPCR का उपयोग कर संस्करण मात्रा में एक ट्यूब प्रारूप है । हमें उम्मीद है कि यह रिपोर्ट अपने काम के लिए dPCR प्लेटफॉर्म अपनाने में दिलचस्पी रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए मददगार है ।
दीन मूल्य अक्सर ठहराव या अनुक्रमण से पहले क्षतिग्रस्त डीएनए (जैसे, formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड ऊतक से gDNA) का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, क्योंकि gDNA के एक उंनत गिरावट कम गुणवत्ता वाले डेटा में परिणाम कर सकते हैं । दीन आकलन है, इस प्रकार, मानव gDNA11की गुणवत्ता नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण कदम बनता जा रहा है । के बाद से प्रतिनिधि प्रयोग में इस्तेमाल किया gDNA 4 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया गया था-11 साल के रक्त से इसकी निकासी के बाद, अपने दीन मूल्यों dPCR परख से पहले एक गुणवत्ता नियंत्रण के लिए निर्धारित किया गया । यह कदम विशेष रूप से यदि सामग्री क्षतिग्रस्त होना संदिग्ध है की सिफारिश की है । gDNA की एकाग्रता भी ट्रो द्वारा निर्धारित की गई थी. क्योंकि dPCR के गतिशील रेंज के रूप में विभाजन की सीमाओं के कारण qPCR के लिए के रूप में व्यापक नहीं है, gDNA एकाग्रता का एक माप एक सफल dPCR परख के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । के रूप में इनपुट डीएनए की राशि dPCR परख में संस्करण और संदर्भ alleles की कुल प्रति संख्या के साथ संबंधित था (आर चुकता = ०.९३५; तालिका 4), ट्रो dPCR परख से पहले gDNA एकाग्रता को मापने के लिए उपयोगी है ।
लोडिंग और सीलिंग प्रक्रियाएं सफल परिणामों के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं । यह मंच पर पीसीआर मिश्रण के उपयुक्त बढ़ते की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है और चिप और मंच के बीच संपर्क सुनिश्चित (चित्रा 1A) । स्लाइडर से पीसीआर मिक्सचर की दखलंदाजी चिप पर अवैध डिस्ट्रीब्यूशन का कारण बन सकती है। एक स्थिति भूखंड पर सकारात्मक और नकारात्मक विभाजन के वितरण की पुष्टि भी एक सटीक विश्लेषण के लिए आवश्यक है, क्योंकि यह Poisson आंकड़ों में माना जाता है कि डीएनए टेंपलेट्स बेतरतीब ढंग से1मंडलों में विभाजित हैं । प्रतिनिधि परिणामों में, सकारात्मक विभाजन चिप भर में वितरित किए गए थे (चित्रा 3). यह परिणाम Poisson आँकड़ों के लिए आवश्यकता को पूरा करता है और यह दर्शाता है कि लोडिंग और सीलिंग प्रक्रियाएँ प्रभावी थीं. जब सीलिंग बढ़ाने में ट्यूबों की स्थापना, चिप्स टूट सकता है अगर ऊपर ढक्कन के मध्य भाग भी जोरदार धक्का दिया है (चित्रा 1ख) । इस से बचने के लिए, धीरे ऊपर ढक्कन के किनारे धक्का । यदि सकारात्मक विभाजन (चित्रा 1D) की एक कृत्रिम क्लस्टर है, विभाजन के बीच एक पार संदूषण के कारण कॉपी संख्या आंका जा सकता है । सील प्रक्रिया में सुधार किया जाना चाहिए अगर तरल की एक पोखर सतह पर दिखाई दे रहा है (चित्रा 1सी) (उदाहरणके लिए, क्रमिक रूप से 1 मिनट के लिए सीलिंग बढ़ाने के द्वारा) । यदि सकारात्मक विभाजन (चित्रा 1ई) का असमान वितरण है, प्रतिलिपि संख्या अपर्याप्त प्रवर्धन या सील द्रव और पानी के संदूषण के कारण आंका जा सकता है । पीसीआर शर्तों इस मामले में समायोजित किया जाना चाहिए [उदाहरणके लिए, तापमान या पीसीआर की अवधि ट्यूनिंग द्वारा (प्रोटोकॉल के चरण ३.११), या सुनिश्चित करना है कि सील द्रव और जिग में डाला पानी साफ कर रहे हैं] । आसुत जल में डूबे 8-ट्यूब स्ट्रिप से प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाया जाता है । यदि हवा के बुलबुले ट्यूब की सतह का पालन करें, वहां संभावना है कि वे संकेत का पता लगाने (चित्रा 1F) के साथ हस्तक्षेप कर सकते है । इसलिए, बुलबुले एक उपकरण, जैसे कि एक ठीक पिपेट टिप का उपयोग कर साफ़ किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, हवा के बुलबुले ट्यूबों के अंदर फार्म कर सकते है जब वे जिग (चित्रा 1जी) में स्थापित कर रहे हैं । अगर ट्यूबों के अंदर बुलबुले काफी बड़े है चिप को कवर करने के लिए, वे भी साफ किया जाना चाहिए । बुलबुले स्पष्ट हो सकता है अगर वे कमरे के तापमान पर कई मिनट के लिए छोड़ दिया जाता है ।
कुछ सकारात्मक विभाजन एनटीसी में पता लगाया जा सकता है । डीएनए टेम्पलेट्स के एक संदूषण से बचने के लिए, बेंच साफ रखने के लिए और, यदि संभव हो, एक प्रशंसक फिल्टर इकाई के साथ एक साफ जगह बनाते हैं । यदि डीएनए टेम्पलेट्स के एक संदूषण संदिग्ध है, अच्छी तरह से अंतरिक्ष को साफ और/या इस्तेमाल किया एजेंट को छोड़ दें । इसके विपरीत, यदि संदर्भ एलील के सकारात्मक विभाजन gDNA की उपस्थिति में पता नहीं कर रहे हैं, gDNA, प्राइमरों की सांद्रता की पुष्टि, और जांच । विशेष रूप से, प्राइमरों प्रतिनिधि प्रयोग में कम एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया, पारंपरिक पीसीआर की तुलना में (1 टेबल)12। यह भी रैंप दर है, जो शायद ही कभी पारंपरिक पीसीआर में बदल जाता है की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
क्या चिप के साथ dPCR बनाता है में एक ट्यूब प्रारूप अद्वितीय सार्वभौमिक 8 के अंदर पीसीआर मिश्रण के विभाजन है ट्यूब8,13पट्टी । एक पीसीआर ट्यूब में विभाजन कक्षों का स्थानांतरण इस प्रणाली में की आवश्यकता नहीं है, इस प्रकार संदूषण जोखिम को कम करने । चिप में एक ट्यूब प्रारूप के साथ dPCR प्रणाली में एक फायदा यह भी है; यह उस dPCR प्रणाली में ९६ परख खत्म करने के लिए < 4 h लेता है, जबकि छोटी बूंद में परख के एक ही नंबर को समाप्त करने के लिए कम से 5 h-आधारित dPCR14लेता है । इसके अलावा, यूनिवर्सल 8 ट्यूब पट्टी एक पारंपरिक थर्मल साइकिल चालक के उपयोग में सक्षम बनाता है, एक और चिप के विपरीत15dPCR आधारित है, जो एक फ्लैट ब्लॉक के साथ एक थर्मल साइकिल चालक की आवश्यकता है । इसके अलावा पारंपरिक पीसीआर के लिए संचित ज्ञान और रिएजेंट dPCR सिस्टम को लागू किया जा सकता है । यह dPCR के आवेदनों के विस्तार के लिए मददगार होगा ।
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि dPCR कई सीमाएं हैं । चिप में एक ट्यूब प्रारूप के साथ dPCR में, चिप के विभाजन की संख्या अन्य dPCR प्लेटफार्मों में उन लोगों के साथ तुलना में अपेक्षाकृत कम है. इसके अलावा चिप डिवाइस के लिए सुधार गतिशील रेंज है, जो विभाजन की संख्या पर निर्भर करता है को बढ़ाने के लिए आवश्यक हो जाएगा । क्योंकि यूनिवर्सल ट्यूब के आंतरिक अंतरिक्ष सीमित है, चिप डिवाइस के लिए एक सफलता डिजाइन विभाजन की संख्या में वृद्धि करने के लिए आवश्यक है । भविष्य में पूरे dPCR प्रक्रिया के स्वचालन बहुत मानव त्रुटि को कम करेगा, और भी अधिक विश्वसनीय परिणाम में जिसके परिणामस्वरूप । अपने उच्च प्रवाह और उच्च संवेदनशीलता प्रकृति के कारण, चिप में एक ट्यूब प्रारूप के साथ dPCR तरल बायोप्सी और पर्यावरण डीएनए के लिए नमूनों की एक संख्या का इलाज करने के लिए लागू होने की उम्मीद है ।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन के लिए एक अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (ग) जापान सोसायटी से विज्ञान के संवर्धन के लिए (JSPS) (सं. 15K08397) Tomoaki Kahyo के लिए, और चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी से अनुदान द्वारा (एमएड) (no. ९२७९६०७१९), खोजपूर्ण अनुसंधान के लिए अनुदान में सहायता (सं. 16K15256), प्रबंधन व्यय अनुदान में एक राष्ट्रीय विश्वविद्यालय सुधार के संवर्धन के लिए एक प्रोत्साहन विशेष बजट की संबद्ध परियोजनाओं के लिए व्यय (no. १०१९२५३), और धूंरपान अनुसंधान फाउंडेशन को Haruhiko Sugimura. लेखक डॉ Iwaizumi और डॉ Kurachi उनके नैदानिक सहायता के लिए धंयवाद । इस पांडुलिपि को तैयार करने में फंड वालों की कोई भूमिका नहीं थी । चित्रा 3, चित्रा 4, और तालिका 4 अनुकूलित कर रहे हैं और Kahyo एट अल द्वारा एक लेख से पुनर्मुद्रित. 10, Elsevier से अनुमति के साथ ।
QIAamp DNA Blood Maxi Kit | Qiagen | 51194 | Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA |
NanoDrop 1000 | ThermoFisher SCIENTIFIC | ND-8000 | Before Protocol 1: Spectrophotometer |
8-strip tube | Agilent Technologies | 401428 | Protocol 1 |
Genomic DNA sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay |
DNA ladder | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay |
MS3 Basic Small Shaker | IKA | 3617000 | Protocol 1: Vortex mixer |
Genomic DNA ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5365 | Protocol 1: Gel device |
2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2965AA | Protocol 1: Electrophoresis instrument |
TapeStation Analysis Software | Agilent Technologies | Bundled with G2965AA | Protocol 1: Analysis software |
DNA oligo primers | IDT | Custom order | Protocol 2 |
LNA probes | IDT | Custom order | Protocol 2 |
Software tool | IDT | Web site: http://biophysics.idtdna.com/ | Protocol 2 |
dbSNP database | NCBI | Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ | Protocol 2 |
TE buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12090015 | Protocol 3 |
DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher SCIENTIFIC | 10977015 | Protocol 3 (Table 1) |
Clarity Digital PCR Probe Mastermix | JN Medsys | 12013 | Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix A component of #10011 |
Clarity Sealing Fluid | JN Medsys | 12005 | Protocol 3: Sealing fluid A component of #10011 |
Clarity JN Solution | JN Medsys | 12006 | Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution A component of #10011 |
Clarity Tube-strip | JN Medsys | 12007 | Protocol 3: Chip-in-a-tube A component of #10011 |
Clarity Sample Loading Kit | JN Medsys | 12008 | Protocol 3: Loading platform and slider A component of #10011 |
Clarity Auto Loader | JN Medsys | 11002 | Protocol 3: Auto loader A component of #10001 |
Clarity Sealing Enhancer | JN Medsys | 11003 | Protocol 3: Sealing enhancer A component of #10001 |
Clarity Reader | JN Medsys | 11004 | Protocol 3: Reader A component of #10001 |
Life Eco Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | Protocol 3: Thermal cycler |
Clarity Software | JN Medsys | Bundled with #10001 | Protocol 3: Analysis software |
High Sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | Protocol 4: Gel device for high sensitivity |