Neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado Peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales
Summary
Aquí, presentamos un método en el que neutrófilos baja densidad humanos (LDN), recuperados del líquido de lavado peritoneal postoperatorio, producen enormes trampas extracelulares neutrófilos (redes) y atrapan eficientemente las células tumorales libres que posteriormente crecen.
Abstract
Activa neutrófilos liberación neutrófilo extracelular trampas (redes), que pueden capturar y destruir microbios. Estudios recientes sugieren que las redes están implicadas en varios procesos de enfermedad como autoinmune enfermedad, trombosis y tumor metástasis. A continuación, os mostramos una técnica detallada en vitro para detectar actividad de red durante la captura de las células tumorales libres, que crecen después de la conexión a redes. En primer lugar, se recopilaron neutrófilos de baja densidad (LDN) de líquido de lavado peritoneal postoperatorio de pacientes sometidos a laparotomies. Cultivo a corto plazo de LDN dio lugar a la masiva formación neta que fue visualizada y contratinción cromosoma nuclear verde fluorescente. Después de la incubación conjunta de líneas celulares de cáncer gástrico humano MKN45, OCUM-1 y NUGC-4 con las redes, muchas células del tumor fueron atrapadas por las redes. Posteriormente, el accesorio completamente fue abrogado por la degradación de las redes con DNasa I. Time-lapse video reveló que no murió atrapadas por las redes de las células del tumor pero en su lugar crecieron vigorosamente en un cultivo continuo. Estos métodos pueden ser aplicados a la detección de interacciones adhesivas entre redes y varios tipos de células y materiales.
Introduction
Neutrófilos nucleares polimorfo en la sangre circulante se separan típicamente de células mononucleares a través del método de preparación de gradiente de densidad. Sin embargo, algunos neutrófilos conocidas como baja densidad neutrófilos (LDN), con fenotipos de CD11b(+), CD15(+), CD16(+) y CD14(-), son co purificados con las células mononucleares. El número relativo de LDN aumenta significativamente en varias condiciones patológicas incluyendo enfermedades autoinmunes1,2, sepsis3y cáncer4,5. Estudios previos han demostrado que LDN son una clase fenotípicamente y funcionalmente distinta de neutrófilos6. Cabe señalar que LDN en la sangre circulante son más propensos a producir neutrófilos trampas extracelulares (redes) de densidad normal neutrófilos2,7. Redes son como estructuras compuestas de ácidos nucleicos, las histonas, proteasas y proteínas citosólicas y granulares, y eficientemente pueden atrapar y destruir patógenos8.
Recientemente, las redes se han demostrado para capturar no sólo microbios, pero también las plaquetas y circulación de las células del tumor que pueden ayudar en trombo formación9 y tumor metástasis10,11. Sin embargo, los mecanismos moleculares detrás de las interacciones adhesivas entre las redes y las plaquetas o células tumorales aún no están claros. Más recientemente, un ensayo de adherencia en vitro reveló que las células de la leucemia mieloide (K56212) y células de carcinoma de pulmón (A54913) conexión a redes de las integrinas β1 y β3. Los autores utilizaron neto stock aislado de neutrófilos y activado por forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) de la adherencia sustrato14. Aunque este ensayo permite la detección de interacciones reales con componentes netos en la ausencia de neutrófilos, es discutible si la “célula libre stock neto” aislado por centrifugación de alta velocidad mantiene la estructura molecular idéntica a las redes producidas en vivo. Recientemente, encontramos del líquido de lavado peritoneal después de cirugía abdominal contiene muchos maduros LDN, que generó enormes redes y conectados a las células del tumor que causa metástasis peritoneal15. En este estudio, se examinó con éxito la adhesión de las células del tumor a redes intactas sin ninguna manipulación física. A continuación, os mostramos detalles de una técnica para detectar las interacciones adhesivas entre redes y células tumorales libres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudios previos han reportado que circulan las células del tumor puede quedar atrapado por sustratos NET en vivo10,11. Las células de cáncer de mama metastásico han demostrado para estimular neutrófilos e inducir la formación de redes, que ayuda en el crecimiento de células tumorales en el órgano blanco del17. Además, se encontró que las culturas a corto plazo de LDN de líquido de lavado postoperatorio producción rede…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Sra. J. Shinohara e I. Nieda para trabajo técnico y administrativo. También, agradecemos a los Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina y Kazuya Takahashi por su colaboración para la adquisición de la muestra en sala de operaciones. Este trabajo fue apoyado por una subvenciones para la investigación científica desde el Ministerio de educación, ciencia, deportes y cultura de Japón y la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (17K 10606).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
Riferimenti
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