Vi beskriver her in vitro- generation af HBV DNA via en Hepatitis B virus infektion system og meget følsomme påvisning af dets (1 – 2 kopier) integration ved hjælp af inverse indlejret PCR.
Hepatitis B Virus (HBV) er en fælles blodbårne patogener, der forårsager leverkræft og lever cirrose som følge af kronisk infektion. Virussen normalt replikater gennem en episomal DNA mellemliggende; dog har integration af HBV DNA fragmenter i vært genom overholdt, selv om denne form ikke er nødvendige for viral replikation. Nøjagtige formål, timing og mekanismer af hvilke HBV DNA integration sker er endnu ikke klart, men de seneste data viser, at det sker meget tidligt efter infektion. Her, er in vitro- generation og påvisning af HBV DNA integrationer beskrevet i detaljer. Vores protokol specifikt forstærker enkelteksemplarer af virus-celle DNA integrationer og giver mulighed for både absolutte kvantificering og enkelt-basepar opløsning af krydset sekvens. Denne teknik er blevet anvendt til forskellige HBV-modtagelige celletyper (herunder primær humane hepatocytter), til forskellige HBV mutanter og i forbindelse med forskellige stof engagementer. Vi forudser denne teknik bliver en nøgle assay til at bestemme de underliggende molekylære mekanismer af denne klinisk relevante fænomen.
HBV er en dobbelt-strenget DNA-virus, der kan forårsage livslang kronisk infektion, føre til skrumpelever og hepatocellulært carcinom (HCC)1,2,3. Mens der er flere molekylære mekanismer HBV persistens4 (f.eks. høj stabilitet i den epigenetiske viral transcriptional skabelon), unddragelse af immun overvågning og lav omsætning af hepatocytter i leveren og dens tilknyttede kørsel risiko for HCC indledning5,6 (fx, kronisk inflammation og aktivering af cellulære understrege veje), HBV DNA integreres vært celle genomet (en rapporteret mekanisme for begge disse fænomener) er blevet dårligt undersøgt . En væsentlig årsag er manglen på egnede in vitro- infektion systemer for HBV der tillader pålidelig detektering af integration begivenheder. Her, beskriver vi en nyligt udviklede protokol for både in vitro- generation og påvisning af HBV DNA integrationer, der kan bruges til at belyse de underliggende molekylære mekanismer og følgerne heraf.
HBV replikering og dannelsen af HBV DNA integration er tidligere blevet gennemgået i detaljer7. Kort, HBV træder hepatocytter med natrium Taurocholate Co-transporting peptid (NTCP) som den vigtigste cellulær receptor for infektion8,9. HBV nucleocapsids indeholdende HBV-afslappet cirkulære DNA (rcDNA) træder genom atomkernen, hvor rcDNA omdannes til episomal kovalent lukkede cirkulære DNA (cccDNA). Den nukleare cccDNA fungerer som skabelonen transcriptional for viral mRNAs og pre genomisk RNA (pgRNA)10. HBV polymerase og pgRNA er så pakket ind i nydannede nucleocapsids (sammensat af HBV core protein dimerer). HBV pgRNA er omvendt-transskriberet inden for nucleocapsid, hvilket resulterer i enten en rcDNA genom eller en dobbelt-strenget lineære DNA (dslDNA) genom11,12. Disse modne nucleocapsids indeholdende HBV DNA genomer er endelig indhyllet og eksporteres som virioner.
Infektion af hepatocytter af indhyllede partikler indeholdende dslDNA molekyler kan resultere i viral integration i den vært celle genom13, fører til replikering-inkompetente former for HBV DNA7,14,15. HBV DNA integration opstår i stedet for kromosomale dobbelt-strenget DNA pauser15. Akkumulere beviser tyder på, at hver integration begivenhed forekommer i en stort set tilfældig position inden for værten celle genom16,17. Derudover HBV DNA integration sker noget sjældent, med en hastighed på 1 / 104 celler13,18,19,20. Vigtige spørgsmål vedrørende HBV DNA integration forbliver ubesvarede, især med hensyn til præcise molekylære veje involveret, afhængigheden af viral og vært faktorer, de virale antigener udtrykt fra integrerede formularer og deres mulige bidrag til viral persistens7. Vi har oprettet en in vitro- model til at kaste lys over nogle af disse spørgsmål.
Sjældenhed af HBV DNA integration events (både med hensyn til integration sats pr. celle og eksemplarnummer hver unik integration) i in vitro- HBV infektion modeller gør dem udfordrende for at opdage. Celle mitosen er begrænset i vores in vitro- system, som delende celler ikke understøtter effektiv infektion. Således, i modsætning til i patientens leveren væv hvor betydelig klonal ekspansion af hepatocytter opstår18,19,20, meget få (1 til 2) kopier af hver integration er til stede i en given gruppe af celler inficeret in vitro- . Vi har også fundet, at integration hovedsagelig opstår under den initiale infektion af hepatocytter (og ikke løbende i kronisk inficeret hepatocytter)13. I overensstemmelse hermed, HBV DNA integration ikke kan øges ved simpelthen dyrkning af celler i en længere periode.
I almindelighed, duppes tidligere metoder til at opdage integreret HBV DNA, herunder sydlige hybridisering21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , kassette-medieret ligatur PCR28, og hele genome sequencing29,30,31,32,33, ikke har følsomhed til at opdage Single-kopier af integrationer. Vi og andre forskere har brugt inverse indlejret PCR (invPCR) for at registrere hepadnaviral DNA integration i duck, woodchuck og menneskelige inficerede lever13,14,18,19, 34,35,36. Andre har indført proceduremæssige ændringer til invPCR teknik, der kan ændre generation af falsk-positive signaler og begrænse muligheden for kvantificering37. Hvis analysen udføres som beskrevet i denne protokol, repræsenterer invPCR en specifik og følsom analyse, som identificerer og kvantificerer (i absolut kopi numre) flere HBV DNA integrationer. HBV-celle DNA krydset er sekventeret på en enkelt-basepar resolution, så bioinformatical undersøgelser af viral og vært DNA sekvenser på steder, hvor integration13.
Vi har tidligere beskrevet38 resultater fra invPCR på DNA af HBV-inficeret væv udvundet fra en lang række kilder, herunder snap-frosne leveren væv, paraffin-embedded lever sektioner og ekstremt små vævsprøver isoleret af laser-microdissection19. Denne protokol beskriver en opdateret version af en invPCR analyse ved hjælp af DNA ekstraheret fra celle kultur-afledte væv efter in vitro- infektion, som genereres lav kopi numre af integrationer (1 – 2 kopier pr. integration). HBV DNA integrationer dannet i vitro ligner dem der findes i patientens væv på deres distribution over det cellulære genom og krydset i den viral sekvens, der er integreret13,16, tyder på en sammenlignelige vej til inden for en inficeret leveren.
Før du udfører protokollen, er det vigtigt at bemærke, at denne invPCR assay er en yderst følsom teknik, i stand til at forstærke enkelt kopier af DNA skabelon. Derfor er begrænse forurening fra PCR produkter af allerstørste betydning. Generelle strategier til at begrænse PCR produktkontaminering omfatter følgende. a etablere fysisk adskilte områder til forskellige trin i metoden. Hvert område skal have separate lab frakker, og handsker bør ændres, når du flytter mellem disse områder. Vi har opført disse områder nedenfor i rækkefølge fra mest at det mindste sandsynligt være kontamineret: PCR produkt udvinding og sekventering reaktion set-up område (post-PCR); PCR skabelon tilsætning og flammede-benet overføre område (vi har brugt PCR emhætter med en dekontaminering UV lampe med gode resultater); DNA-ekstraktion og inversion område (pre-PCR); og et “DNA-skabelon-fri” område anvendes udelukkende til udarbejdelsen af materiel og PCR løsninger. (ii) være opmærksom på luft flow i lab som en potentiel drivkraft for krydskontaminering. Især krydskontaminering af PCR reaktioner under trinnet flammede pin overførsel er mest sandsynligt at forekomme og vil føre til unøjagtige kvantificering af integration frekvens. PCR hætter kan bruges til at begrænse disse cross-strømme. Negativ kontrol wells (f.eks. Myrcludex B-behandlede prøver eller ingen skabelon kontrol) i PCR kan også bruges til at teste for krydskontaminering. (iii) begrænse potentielle PCR forureninger på pipetter og arbejde overflader jævnligt tørre dem med en DNA nedbrydning løsning.
Den protokol, der er angivet her er arrangeret at opdage integration af en kendt smitsomme HBV klon genereret fra HepAD38 celle linje42. Hvis inokulum bruges af en anden HBV DNA sekvens (f.eks. fra patientens serum), bør derefter HBV genom være første sekventeret for at bekræfte kompatibilitet af PCR primere og inversion design. I tidligere offentliggjorte studier19, har vi brugt 3 sæt primere, som binder bevarede HBV DNA sekvenser flankerer den forventede site af HBV DNA integration vejkryds. Andre primer sekvenser og protokoller er blevet beskrevet til at bestemme genomisk rækkefølgen af HBV44,45,46,47,48 og kan arbejde med succes.
Derudover kan forskellige HBV-følsomme celler (f.eks. primære humane hepatocytter, differentierede HepaRG, HepG2-NTCP celler) bruges; Vi har dog konstateret, at Huh7-NTCP celler giver den største signal / støj-forhold, når de overvejer antallet af virus-celle DNA vejkryds, der er forstærket i forhold til virus mellemliggende DNA, der er forstærket13. Især undergår terminalt differentieret celler som primære humane hepatocytter eller differentierede HepaRG ikke effektivt mitose, hvilket resulterer i et højt niveau af amplifiable HBV DNA replicative mellemprodukter resterende i cellerne. Vi har fundet, at ~ 90% af forstærkede sekvenser repræsenterer HBV DNA rearrangementer (og ikke integration begivenheder) i terminalt differentieret celler, i forhold til 70-50% i hepatoma celle linjer13. Disse produkter er generelt HBV DNA genomer indeholdende store sletninger i overfladen og core åben læsning rammer, eller de kan repræsentere HBV kvasi arter med en ekstra Ncojeg site forud for Sphjeg site. Forstærkningen af disse HBV arter (herunder et skematisk diagram) er blevet beskrevet i detaljer tidligere13.
Der er flere ulemper til denne metode. På grund af den besværlige og multi-dages karakter af denne protokol, er invPCR ikke velegnet til høj overførselshastighed analyser af et stort antal prøver. Desuden, som det bygger på begrænsning af fortynding titrering, vores metode er ikke meget præcise i kvantificering; selv om det bør nemt måle log-niveau ændringer i integration frekvens.
Desuden er vores inversion protokol kun egnet til at opdage integrationer mellem regionen DR2 og DR1 af HBV genom, som fleste af HBV integrationer forekomme inden for denne region49. NGS analyse af HBV patient væv har vist, at et stort mindretal (op til ~ 50%) kan også forekomme uden for denne region49. Nye invPCR designs er teoretisk købedygtig opdager disse andre websteder, integration, selv om de har ikke (til vores viden) blevet gennemført endnu. Boligområdet, på grund af de nødvendige begrænsning enzym steder kræves nedstrøms fra virus-celle junction sekvens for inversion reaktion, invPCR ikke registrerer alle integrationer forekommer inden for DR2 og DR1 regionerne af HBV genom (dvs, vi har anslået at ~ 10% af alle integrationer kan registreres ved hjælp af i siliciummangan simuleringer13). Men når de påføres en fokuseret batch af prøver med et lille antal forskellige behandlinger, invPCR er en af de eneste praktiske metoder til påvisning af integrerede HBV DNA på en enkelt basepar opløsning.
Vi derfor envision anvendelser af denne metode tjener en nøglerolle i at finde viral (via mutationer af HBV inokulum), cellular (gennem knockout eller overekspression af specifikke cellulære gener, eller ved anvendelse af forskellige stoffer) og miljømæssige ( fx eksponering for oxidativt stress) faktorer, der inducerer HBV DNA integration. Med denne metode og nyudviklede HBV infektion systemer aktivere vi hidtil uset kontrol af disse faktorer, så de kan være godt isoleret og bedre karakteriseret. Vi forventer også, at dette vil føre til en afgørende forståelse af cellulære konsekvenserne af HBV DNA integration, herunder til hvilken grad virale antigener (fx HBx eller HBsAg50) udtrykkes fra integreret form, hvad styrer dette udtryk, og eller ej HBV integration væsentligt ændrer den cellulære fænotype hen imod en mere pro-mutationer tilstand. Resultaterne af disse fremtidige undersøgelser vil have en dybtgående indflydelse på de terapeutiske strategier, der anvendes til behandling af kronisk hepatitis B og på den grundlæggende forståelse af selve virus.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde fik støtte fra den tyske infektion forskning (DZIF), TTU Hepatitis projekter 5.807 og 5.704, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 (TP 15), og den australske Center for HIV og Hepatitis virologi forskning.
Vi står i gæld til Professor William Mason for sin rolle i udviklingen af den oprindelige invPCR metode og viser det til os. Vi vil gerne takke Drs. Yi Ni og Florian A. Lempp for reagenser (cellelinjer og HBV inokulum). Vi anerkender Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt og Dr. Katrin Schöneweis for teknisk bistand. Vi er taknemmelige for Miriam Kleinig til korrekturlæsning og professorer Nicholas Shackel og Ralf Bartenschlager for løbende support.
Dulbecco’s PBS | PAA | H15-002 | |
DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 41965 | |
Fetal bovine serum | PAA | A15-151 | Heat-inactivate before use |
Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100× | PAA | P11-010 | |
L-glutamine, 200mM | PAA | M11-004 | |
Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1× | PAA | L11-004 | |
PEG, MW 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use |
DMSO for spectroscopy | Merck | 102950 | |
Tenofovir disoproxil | Sigma-Aldrich | CDS021622 | Dissolve in DMSO |
Lamivudine | Sigma-Aldrich | L1295 | Dissolve in DMSO |
NucleoSpin Tissue kit | Macherey Nagel | 740952.250 | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
NcoI-HF | NEB | R3193L | |
T4 DNA ligase | NEB | M0202T | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 433209 | |
Dextran (35 -45 kDa) | Sigma-Aldrich | D1662-10G | |
Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 32205-1L-D | |
BsiHKAI | NEB | R0570L | |
SphI-HF | NEB | R3182L | |
Amplitaq Gold Taq kit | Thermo Fisher Scientific | 4331816 | Use for first nest PCR |
Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates | Biorad | 2239442 | |
DNAZap PCR DNA Degradation Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9890 | |
96-well PCR plates | Sigma Aldrich | CLS6509 SIGMA | |
96-pin replicator | Thermo Fisher Scientific | 250520 | |
GoTaq Flexi PCR kit | Promega | M8295 | Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel |
Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
QIAEX II Gel extraction kit | QIAGEN | 20051 |