Presentamos uso de microscopia de 2 fotones a una micropipeta dentro del espacio urinario de Bowman en los ratones, la combinación de 2 técnicas fundamentales de la fisiología renal. Uso de la microscopia de 2 fotones supera críticas limitaciones de la microscopia convencional para estudios de micropunción fisiología renal.
Micropunción renal y renal 2-photon imaging son técnicas seminales en la fisiología renal. Sin embargo, micropunción está limitada por la dependencia en microscopia convencional a las nefronas superficiales características y estudios de 2 fotones se limitan en que las intervenciones sólo pueden ser evaluadas en el órgano, más bien que el nivel de la nefrona. En particular, estudios de micropunción de los glomérulos de los ratones han sido desmentidos por la escasez de superficie glomérulos en ratones. Para solucionar esta limitación para llevar a cabo estudios de aspirado del espacio de Bowman en modelos fisiológicos de ratón, que desarrollamos micropunción glomerular 2 fotones. Presentamos una novedosa preparación quirúrgica que permite el acceso lateral al riñón preservando la columna imagen vertical requiere de 2 fotones microscopía. Administración de alto peso molecular isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran se utiliza para representar la vasculatura renal y glomérulos visible para la proyección de imagen de 2 fotones. Luego se introduce una pipeta de punto cubrió quantum bajo guía estereotáctica a un glomérulo de varios a muchos de los cuales pueden visualizarse en la ventana de imagen. En este protocolo, nos proporcionan detalles de la preparación, materiales y métodos necesarios para llevar a cabo el procedimiento. Esta técnica facilita previamente imposible estudio fisiológica del riñón, incluyendo todos los segmentos de la nefrona en la proyección de imagen límite de profundidad, cerca de 100 μm por debajo de la cápsula renal y recuperación del filtrado desde el espacio de Bowman. Presión, carga y flujo se pueden todos medir con la pipeta de introducidas. Aquí, nos proporcionan datos representativos de cromatografía de líquidos/masas espectrometría en aspirado del espacio de Bowman. Esperamos que esta técnica tiene amplia aplicabilidad en la investigación fisiológica renal.
El objetivo de este procedimiento es rutinario micropunción acceso al espacio de Bowman y otras estructuras glomerulares en ratones. Estudios de micropunción de fisiología renal se han limitado a 1 fotones microscopía, que solo pueden tomar imágenes dentro de unas pocas micras de la superficie del riñón, y que ofrece una precisión limitada en la dimensión z. Porque los ratones tienen pocos glomérulos superficiales, no siempre es posible encontrar una superficie glomérulo por microscopia 1 fotón, por lo tanto se han realizado más estudios de micropunción en ratas Wistar de Munich, que tienen más numerosos glomérulos superficiales. Por lo tanto, los beneficios de trabajar en modelos de ratón han sido limitados en estudios de micropunción1,2,3. Los avances recientes en tecnologías, incluyendo micro-CT4,5, nanopartículas6la proyección de imagen y espectrometría de masa7 la proyección de imagen han mejorado considerablemente la gama de modalidades aplicables a la fisiología glomerular, pero queda nada que sustituya a la única capacidad de intervenir y eso micropunción de la muestra. Por lo tanto extendiendo el uso de micropunción usando las técnicas presentadas aquí se espera facilitar estudios de fisiología renal novela, en particular, evaluación de los contenidos del filtrado renal (es decir, metabolómica) y fisiología básica de la ratones transgénicos, tales como medidas de presión de filtrado y carga, sólo en ratas.
En esta técnica, uso de 2 fotones microscopía permite la visualización y acceso de la micropipeta a estructuras renales hasta cerca de 100 μm por debajo de la cápsula renal. Varios glomérulos (5 – 10) por lo tanto son accesibles para micropunción en cada riñón de ratón reflejado hasta el momento. Aunque esta técnica comparte algunas características con micropunción renal convencional, fue diseñado de novo y modificaciones extensas de la técnica convencional se requieren. En este protocolo demuestran la aspiración de líquido desde el espacio de Bowman y mostrar resultados de ejemplo de posteriores análisis con espectrometría de masas (nanoproteomics)8,9,10,11. Uso aguas abajo de espectrometría de masas requiere una muestra especializada preparación flujo de trabajo, que también se demuestra aquí.
Se presenta un método para acceder a espacio de Bowman de glomérulos no-superficie en ratones, facilitados por microscopia 2 fotones. Hemos desarrollado este procedimiento para solucionar una limitación clave de micropunción glomerular, la rareza de glomérulos superficiales direccionables por microscopia 1 fotón en ratones, con el fin de facilitar un objetivo experimental, aspiración de líquido desde el espacio de Bowman para análisis subsecuente. Desarrollo y la práctica de esta técnica se basa en seis pasos críticos. En primer lugar, la novela preparación quirúrgica debe cuidadosamente llevará a cabo para que la proyección de imagen de columna de agua no funcionan con el cubreobjetos y el cubreobjetos se extiende sobre el área del riñón que es el objetivo de la pipeta. En segundo lugar, la pipeta de vidrio utilizada para micropunción debe hacerse visible por microscopía 2-photon, que se logra usando puntos cuánticos. Tercera técnica estereotáctica es necesaria precisamente colocar una pipeta en el espacio de Bowman en tres dimensiones, hasta 100 μm por debajo de la superficie del riñón. Por lo tanto, registrar los sistemas de coordenadas de la pipeta y el escenario con precisión es pasos críticos. Cuarto, cuidadosa selección de los glomérulos de destino es necesario garantizar es accesible a la pipeta sin choque por la estructura de soporte renal y columna de imagen. Por último, debe prestar cuidadosa atención a los pasos analíticos a seguir el procedimiento de adquisición, y volumen y el momento de la adquisición de las muestras de líquido deben corresponder al análisis y a la fisiología glomerular.
Hemos diseñado un procedimiento de adquisición que puede extenderse a muchos análisis, incluyendo las terminales de micropunción tradicionales, como la fotometría de llama, electrodo sensible al ion mediciones o mediciones de presión, volumen o carga. Además, creemos que esta técnica sea susceptible de nuevos extremos analíticos incluyendo reacción en cadena de polimerasa (quizás después de reversa de la transcripción para miRNA) y metabolómica aguas abajo de la espectrometría de masas. Las modificaciones especiales para facilitar la espectrometría de masas merecen discusión adicional, y que imponen algunas limitaciones. En primer lugar, aunque la espectrometría de masas es muy sensible, el contenido bajo en proteínas y volumen de las muestras de micropunción hace análisis de proteínas por debajo del rango dinámico de exploración convencional de la proteómica, y por lo tanto nanoproteomics simplificados necesario. 8 , 13 en segundo lugar, para optimizar el rendimiento de proteína para los primeros ensayos, se determinó que nL 200-300 de aspirado era necesario, pero de nuevo filtrado adquisición de este volumen requeriría quizás mientras 20 minutos de aspiración si el ratón GFR es solamente 8-14 nL / min3. Como Tojo y Endou demostraron que la aspiración prolongada altera el contenido de albúmina de líquido tempranos del túbulo proximal14, elegimos para aspirar más de 6 minutos; sin embargo esto significa que nuestra tasa de aspiración superior a la tasa de entrada de filtrado. Los usuarios de este procedimiento se anima a tener en cuenta la fisiología de la filtración glomerular en su sistema experimental en el diseño de su flujo de trabajo. Espectrometría de masas, una técnica sensible, abrumado por la señal de un destilado de petróleo introducidas tales como aceite mineral, que se utiliza comúnmente en micropunción comprenden el sistema hidráulico de aspiración y aislar segmentos de la nefrona. Por lo tanto, no podríamos usar aceite mineral para este propósito, o su otros común uso, cuantificación del volumen de las muestras de gama nanoliter. En su lugar llena el sistema con perfluorodecalina que es biológicamente inerte, no perturba la espectrometría de masas y tiene características ópticas favorables. Creemos que las limitaciones impuestas por perfluorodecalina son superables y están trabajando en más innovaciones técnicas que esperamos que permitirá la medición de volumen de la muestra y el bloqueo de los segmentos tubulares.
Se han realizado más estudios de micropunción en ratas Wistar de Munich, que demostró el aumento en el número de glomérulos superficiales, pero este estudio fisiológico muy limitada de transporte tubular y otros fisiología renal debido a la pérdida de la fundamental herramienta de la biología molecular, ratones transgénicos2,3. Porque facilita el acceso de la micropipeta al espacio de Bowman en ratones, la nueva técnica por lo tanto mitiga estas limitaciones críticas. Hemos adoptado esta técnica para poder acceder a filtrado renal estudios de proteómica utilizando espectrometría de masas de alta sensibilidad, conocido como nanoproteomics9. Sin embargo, hay probabilidades de aplicaciones adicionales. Por ejemplo, estudio renal fisiológica de la proteína filtrada ha sido grandemente ayudado por uso de trazadores fluorescentes con 2 fotones microscopía15,16,17. Además de micropunción 2 fotones microscopía ofrece la posibilidad de realizar estudio fisiológico solo nephron con moléculas fluorescentes, permitiendo nefronas vecinas, no servir como controles. Se espera que esta explicación clara de los pasos necesarios permitirá amplia adopción en los laboratorios ya equipados para 2 fotones microscopía o micropunción. Aunque es complejo, ahora hemos realizado este procedimiento muchas veces y los refinamientos presentados representan una plataforma estable para el descubrimiento fisiológico.
The authors have nothing to disclose.
NIDDK K08 DK090754 a MPH. NIGMS P41 GM103493 a RDS. Este material es el resultado de la obra (MPH) que fue apoyado con recursos y el uso de instalaciones en el centro de médico de asuntos de veteranos de Portland. Los contenidos no representan las opiniones del Departamento de Asuntos Veteranos de Estados Unidos o el gobierno de Estados Unidos.
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |