Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal
Summary
Dinámica adhesión de células inmunes a la pared del vaso es un prerrequisito para autoguiado hacia el blanco gut. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo funcional en vitro para el análisis del impacto de los anticuerpos anti-integrina, quimioquinas u otros factores de la adherencia de la célula dinámica de células humanas mediante capilares histórico cubierto.
Abstract
Gut autoguiado hacia el blanco de las células inmunes es importante para la patogenia de las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). La adhesión celular dependiente de la integrina a addressins es un paso crucial en este proceso y estrategias terapéuticas interfiere con la adherencia se han establecido con éxito. Anticuerpo integrina α4β7 anti, vedolizumab, se utiliza para el tratamiento clínico de la enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (Cu) y otros compuestos son propensos a seguir.
Los detalles de la adhesión y los mecanismos de acción de los anticuerpos anti-integrina aún no están claros en muchos aspectos debido a las limitadas técnicas disponibles para la investigación funcional en este campo.
Aquí, presentamos un ensayo de adherencia dinámico para el análisis funcional de la adherencia de la célula humana bajo condiciones de flujo y el impacto de las terapias anti-integrina en el contexto de la EII. Se basa en la perfusión de las células primarias humanas a través de Capillares de vidrio ultrafina histórico cubierto con análisis microscópico en tiempo real. El ensayo ofrece una variedad de oportunidades de mejoras y modificaciones y tiene potencial para descubrimientos mecanicistas y aplicaciones traslacionales.
Introduction
Movimiento de la célula es un proceso estrechamente regulado indispensable para el desarrollo y función de organismos multicelulares, pero está también implicado en la patogenesia de una multitud de enfermedades1. Recientemente, el proceso de autodirección de las células inmunes de la sangre a los tejidos periféricos ha ganado cada vez más atención, ya que contribuye a la reposición y expansión de células patógenas en los tejidos inflamados en enfermedades inmunológico2 ,3. En particular, homing ha demostrado tener relevancia traslacional en las enfermedades inflamatorias intestinales (EII). La terapéutica anti-α4β7 integrina anticuerpo vedolizumab interferir con homing gut ha demostrado eficacia en ensayos clínicos grandes4,5 y se ha utilizado con éxito en la práctica clínica del mundo real6,7 , 8. compuestos adicionales están probables que siga9,10. Del mismo modo, el anticuerpo integrina de terapéutica anti-α4, natalizumab, se utiliza para el tratamiento de la esclerosis múltiple (EM)11.
Sin embargo, nuestro entendimiento funcional del proceso autoguiados hacia el blanco en general y el mecanismo de acción de estos anticuerpos terapéuticos en particular es todavía limitada. Está bien establecido que homing consiste en varios pasos, incluyendo la inmovilización de células y que rueda con adherencia posterior de la célula hacia la detención firme seguido por trans migración endotelial12,13. Los mencionados anticuerpos neutralizan las integrinas en la superficie celular impidiendo la interacción con addressins en el endotelio de la pared del vaso. Esto se piensa para impedir firme célula adherencia14,15. Sin embargo, sólo estamos empezando a comprender la relevancia diferencial de integrinas específicas para autoguiado hacia el blanco celular de subconjuntos distintos de la célula. Además, los efectos de los anticuerpos anti-integrina en diferentes subconjuntos de células y asociaciones de dosis-respuesta son en gran parte desconocidas a un montón de preguntas abiertas en el campo de terapias autoguiados hacia el blanco y la adherencia intestinal en la EII.
Por lo tanto, se necesitan desesperadamente herramientas prácticas para abordar estas cuestiones. El efecto de los anticuerpos anti-integrina en interacción integrina-histórico predominante hasta ahora ha sido evaluado mediante la evaluación de la inhibición de la eficacia/obligatorio vinculante con citometría de flujo o a través de la adherencia estática ensayos16,17 ,18,19,20, así con aparente simplificación y desviación de la situación fisiológica. Recientemente establecimos un ensayo de adherencia dinámica para estudiar la adhesión dependiente de integrinas de las células humanas a addressins y los efectos de los anticuerpos anti-integrina bajo tensión de esquileo2. El principio de la técnica anterior se ha demostrado con células de ratón21,22. Aquí, fue adaptado y desarrollado para responder las preguntas mencionadas traslacionales, apertura nuevas avenidas para mejor comprender los mecanismos de la terapia con anticuerpos anti-integrina en vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo de arriba describe una técnica útil para estudiar la dinámica adhesión de células inmunes humanas a ligandos endoteliales. A través de la variación de los ligandos revestidos, tipos de la célula inundada o subconjuntos, incubación con estímulos adicionales o diferentes anticuerpos neutralizantes, tiene casi ilimitadas aplicaciones potenciales. Por lo tanto, estos ensayos de adhesión dinámica pueden ser útiles para responder a dos preguntas fundamentales de investigación básica y traslacionales…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación de CN, IA, SZ y NMF fue apoyada por el centro interdisciplinario de investigación clínica (IZKF) y el programa ELAN de la Universidad de Erlangen-Nuremberg, Else Kröner-Fresenius-Stiftung, la Fritz-Bender-Stiftung, de Crohn alemán y Colitis Foundation (DCCV), la investigación clínica grupo CEDER el Consejo alemán de investigaciones (DFG), el programa de tema DFG en la Microbiota, la iniciativa de campo emergente y la DFG colaboración investigación centros 643, 796 y 1181.
Materials
| 48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
Riferimenti
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