Transplantatie-geschikt retinale Pigment epitheel Tissue Engineering afgeleid van menselijke embryonale stamcellen

Summary

Beschrijven we een methode om ingenieur een retinale weefsel samengesteld van retinale pigment epitheliale cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen gekweekt op de top van menselijke vruchtwater membranen en de voorbereiding voor de transplantatie in diermodellen.

Abstract

Verscheidene pathologische condities van het oog van invloed op de functionaliteit en/of het voortbestaan van de retinale pigment epitheel (RPE). Het gaat hierbij om sommige vormen van retinitis pigmentosa (RP) en leeftijdsgebonden Macula Degeneratie (AMD). Celtherapie is een van de meest veelbelovende therapeutische strategieën voorgesteld om te genezen van deze ziekten, met al bemoedigende voorlopige resultaten bij de mens. Echter, de methode voor de bereiding van de prothese heeft een grote invloed op haar functionele uitkomsten in vivo. Inderdaad, RPE cellen als een celsuspensie geënt zijn minder functioneel dan dezelfde cellen getransplanteerd als retinale weefsel. Hierin beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode ingenieur RPE weefsel en de voorbereiding voor de implantatie van een in vivo . RPE cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen worden overgeënt op een biologische drager, het menselijke vruchtwater membraan (hAM). Deze steun heeft vergeleken met kunstmatige steigers, het voordeel van het hebben van een kelder membraan dat dicht bij de de Bruch membraan waar endogene RPE cellen zijn gekoppeld. Echter, de manipulatie is niet gemakkelijk, en we verschillende strategieën voor de juiste kweken en voorbereiding voor het enten van in vivoontwikkeld.

Introduction

RPE is van cruciaal belang voor de overleving en de homeostase van de researchdieren waarmee het strak gekoppeld¹is. Verscheidene pathologische condities wijzigen zijn functionaliteit en/of overleving, met inbegrip van RP en AMD.

RP is een groep van erfelijke monogeen mutaties die invloed hebben op de functies van researchdieren of RPE cellen of beide^2,3. Geschat wordt dat mutaties die van invloed zijn speciaal de RPE goed voor 5% van RP²cellen. AMD is een andere aandoening waar de RPE laag wordt gewijzigd, toonaangevende uiteindelijk tot centrale visie verlies. AMD wordt veroorzaakt door de complexe interacties tussen genetische en omgevingsfactoren en beïnvloedt de oudere^4,5,6. Volgens de prognoses, zal AMD een zorg van 196 miljoen patiënten wereldwijd door 2020⁷zijn. Voor deze stoornissen, geen doeltreffende behandeling bestaat, en een van de voorgestelde strategieën transplantatie van nieuwe RPE cellen ter compensatie van de doden/deactiveren bestaande RPE cellen⁸.

De wijze van formulering van het eindproduct te worden geënt is essentieel om ervoor te zorgen de beste functionele resultaten. RPE cellen geïnjecteerd als een celsuspensie, ondanks het feit dat een gemakkelijke en eenvoudige methode van levering, bezorgdheid met betrekking tot hun voortbestaan, integratie en functionaliteit^{9,10,11,12 , 13}. wetenschappers ontwikkelen nu meer complexe formuleringen te leveren ontworpen retinale weefsel^{9,13,14,15,16}. In dit verband ontwikkelden we een originele methode voor het genereren van in vitro RPE weefsel, dat kan worden gebruikt voor transplantatie⁹.

RPE celbanken afgeleid van menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen worden in dit protocol gebruikt. Echter alternatief RPE cel banken uit andere cel bronnen (mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen, primaire RPE cellen, enz.) en gedifferentieerd met een andere methode zijn ook geschikt voor dit protocol. Het bevat gerichte differentiatie protocollen met behulp van cytokines en/of kleine moleculen^{17,18,19,20,21,22}.

Om te worden getransplanteerd, moet de gemanipuleerde weefsel worden voorbereid op een steiger. In de afgelopen jaren, werden verschillende steigers ontwikkeld gebaseerd op een polymeer of op een matrix van biologische herkomst^13,23,24. Hier, de biologische substraat gebruikt is de hAM, maar andere substraten, zoals kale Bruch membranen, kunnen worden uitgevoerd. De hierin beschreven methode heeft het voordeel van het gebruik van een biologische steiger die meer relevant is voor het RPE inheemse milieu.

Menselijke ES cel-afgeleide RPE cellen worden gekweekt ten minste 4 weken om volledig worden georganiseerd als een geplaveide enkelgelaagde. In dat stadium, het epithelium verkregen is functioneel en gepolariseerde⁹. Ten slotte, zoals dit weefsel rimpels gemakkelijk, het is ingebed in een dunne laag van een hydrogel vervoerder te geven meer stevigheid en elasticiteit en te beveiligen tijdens de injectie-procedure. Dit product wordt vervolgens opgeslagen bij 4 ° C tot enten.

Protocol

Alle menselijke in dit protocol gebruikte materialen werden gebruikt overeenkomstig de bepalingen van de Europese Unie. De menselijke ES cellijn gebruikt in deze studie werd ontleend aan een unieke embryo. Het echtpaar had geschonken de embryo was volledig op de hoogte en gaf hun toestemming voor een anonieme donatie. Een menselijke ES cellijn van klinische-grade was afgeleid van dit embryo, dwarshelling, gekwalificeerd en goed gedocumenteerd door de cellen van de Roslin (UK). Hammen werden aangeschaft onder steriele oms…

Representative Results

Hammen bevatten een epitheliale laag die moet worden verwijderd voordat het zaaien van RPE cellen. Een enzymatische behandeling van het membraan wordt uitgevoerd met de thermolysin onder het schudden. Om niet te niet verliezen de polariteit van het membraan (het epitheel is aan de ene kant), het is gefixeerd op een drager welke samenstelling afhankelijk van de provider (figuur 1A afwijken kan). Controleer de hechting van het membraan te zijn steun bij deze st…

Discussion

We beschreven een methode voor de cultuur van RPE cellen op een biologische steiger en de voorbereiding voor de implantatie in diermodellen. Een van de essentiële stappen van het protocol is het onderhoud van de oriëntatie van de hAM langs de procedure tot haar opneming in gelatine. Inderdaad, de inheemse epitheel van het membraan is verwijderd en haar kelder membraan wordt blootgesteld⁹. De RPE-cellen moeten worden ontpit op de top van dit membraan kelder. Bij de voorbereiding voor het insluite…

Materials

Sterile biosafety cabinet	TechGen International	Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration	Vacuubrand	BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator	Thermo Electron Corporation	BVC 21 NT
200 µL pipette: P200	Gilson	F144565
1 mL pipette: P1000	Gilson	F144566
Pipet aid	Drummond	75001
+4 °C refrigerator	Liebherr	Not applicable
Vibratome	Leica	VT1000S
Fine scissors	WPI	501758
Forceps (x2)	WPI	555227F
Water bath	Grant subaqua pro	SUB6
Precision balance	Sartorius	CP225D
Centrifuge	Eppendorff	5804
Microscope	Olympus	SC30
Horizontal Rocking Shaker	IKA-WERKE	IKA MTS 214D
Vortex	VWR	LAB DANCER S40
Disposable Scalpel	WPI	500351
plastic paraffin film	VWR	PM992
0.200 µm single use syringe filter	SARTORIUS	16532
Syringe without needle 50 mL	Dutscher	50012
Bottles 250mL	Dutscher	28024
15 mL sterile Falcon tubes	Dutscher	352097
50 mL sterile Falcon tubes	Dutscher	352098
culture insert	Scaffdex	C00001N
60 mm cell culture disches: B6	Dutscher	353004
12 well cell culture plate	Corning	3512
6-well culture plates	Corning	3506
Razor blades	Ted Pella, Inc	121-9
Cyanoacrylate glue	Castorama	3178040670105
PBS 1X (500 mL)	Sigma	D8537
Thermolysine	Roche	5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX	Invitrogen	61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)	Invitrogen	12618-013
MEM-NEAA (100X)	Invitrogen	11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM)	Invitrogen	31350-010
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140122
CO2-independent medium	GIBCO	18045-054
Gelatin	MERCK	104078
human amniotic membrane	Tissue bank St Louis hospital (Paris, France)	Not applicable