Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen

Summary

Wir beschreiben eine Methode um eine netzhautgewebe bestehend aus retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gezüchtet auf menschliche amniotic Membranen und deren Vorbereitung für die Verpflanzung in Tiermodellen zu konstruieren.

Abstract

Mehreren pathologische Zuständen des Auges beeinträchtigen die Funktionalität bzw. das Überleben des retinalen Pigmentepithels (RPE). Dazu gehören einige Formen der Retinitis Pigmentosa (RP) und Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD). Zelltherapie ist eines der vielversprechendsten therapeutischen Strategien vorgeschlagen, diese Krankheiten bereits ermutigende Zwischenstand beim Menschen zu heilen. Die Methode der Zubereitung des Transplantats hat jedoch erhebliche Auswirkungen auf die funktionellen Ergebnisse in Vivo. RPE-Zellen als eine Zellsuspension gepfropft sind nämlich weniger funktional als die gleichen Zellen als eine netzhautgewebe transplantiert. Hier beschreiben wir eine einfache und reproduzierbare Methode, Ingenieur RPE Gewebe und deren Vorbereitung für eine Implantation in Vivo . RPE Zellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen sind auf eine biologische Unterstützung, die menschlichen amniotic Membrane (Schinken) ausgesät. Im Vergleich zu künstlichen Gerüste, hat diese Unterstützung den Vorteil, dass eine Basalmembran, die in der Nähe der Bruch-Membran ist wo endogene RPE-Zellen verbunden sind. Jedoch seine Manipulation ist nicht einfach, und wir mehrere Strategien für seine ordnungsgemäße Kultivierung und Vorbereitung für die Verpflanzung in Vivoentwickelt.

Introduction

RPE ist entscheidend für das Überleben und die Homöostase der Photorezeptoren mit denen sie eng verbunden¹ist. Verschiedene pathologische Zustände verändern seine Funktionalität und/oder überleben, darunter RP und AMD.

RP ist eine Gruppe von geerbten monogenen Mutationen, die die Funktionen der Photorezeptoren oder RPE-Zellen oder beide^2,3betreffen. Es wird geschätzt, dass Mutationen, die betreffen speziell die RPE Zellen machen 5 % der RP². AMD ist eine weitere Bedingung wo die RPE-Schicht verändert ist, führende letztlich zu zentralen Sehverlust. AMD wird durch das komplexe Zusammenspiel von genetischen und umweltbedingten Faktoren verursacht und wirkt sich auf die ältere^4,5,6. Prognosen zufolge wird AMD eine Sorge um 196 Millionen Patienten weltweit durch 2020⁷sein. Bei diesen Erkrankungen keine wirksame Heilung gibt, und eine der vorgeschlagenen Strategien ist die Transplantation von neuen RPE-Zellen um Toten/nicht funktionsfähige vorbestehenden RPE Zellen⁸zu kompensieren.

Die Formulierung des Endproduktes, veredelt werden ist wichtig, um die besten funktionellen Ergebnisse sicherzustellen. RPE-Zellen als eine Zellsuspension, trotz des Seins eine einfach Art der Lieferung, injiziert Bedenken bezüglich deren Überleben, Integration und Funktionalität^{9,10,11,12 , 13}. Wissenschaftler entwickeln jetzt mehr komplexe Rezepturen liefern entwickelt netzhautgewebe^{9,13,14,15,16}. In diesem Zusammenhang entwickelten wir eine originelle Methode zur in-vitro- RPE Gewebe zu generieren, die für die Transplantation⁹verwendet werden könnten.

RPE zellbanken abgeleitet von menschlichen embryonalen Stammzellen (ES) sind in diesem Protokoll verwendet. Jedoch Alternative RPE Zellen Banken aus verschiedenen Zelle Quellen (Human-induzierte pluripotente Stammzellen, primäre RPE-Zellen usw.)und differenziert mit einer anderen Methode eignen sich auch für dieses Protokoll. Freuen Sie sich auf gezielte Differenzierung Protokolle mit Zytokinen und/oder kleine Moleküle^{17,18,19,20,21,22}.

Um transplantiert werden, sollte das technische Gewebe auf einem Gerüst vorbereitet werden. In den letzten Jahren wurden verschiedene Gerüste basierend auf ein Polymer oder eine Matrix von biologischen Ursprungs^13,23,24entwickelt. Hier, die biologische Substrat verwendet ist der Schinken, aber andere Substrate wie entblößt Bruch Membranen umgesetzt werden könnte. Die hier beschriebene Methode hat den Vorteil der Verwendung einer biologischen Gerüst, das für die RPE nativen Umgebung relevant ist.

Menschlichen ES Zellen gewonnenen RPE-Zellen sind für mindestens 4 Wochen kultiviert, um voll und ganz als ein Kopfsteinpflaster Monolage organisiert werden. In diesem Stadium das Epithel erhalten ist funktional und⁹polarisiert. Da dieses Gewebe leicht Falten, wird sie schließlich in einer dünnen Schicht aus einem Hydrogel-Träger, mehr Steifigkeit und Elastizität zu geben und zu schützen während der Injektion eingebettet. Dieses Produkt wird dann bei 4 ° C bis Pfropfung gespeichert.

Protocol

Alle Menschen in diesem Protokoll verwendete Materialien wurden nach Verordnungen der Europäischen Union verwendet. Die menschliche ES-Zell-Linie, die in dieser Studie verwendeten stammt aus einem einzigartigen Embryo. Das Paar, das den Embryo gespendet hatte wurde umfassend informiert und gaben ihre Zustimmung für eine anonyme Spende. Eine klinische Grade menschliche ES Zelllinie wurde abgeleitet von diesem Embryo, überhöht, qualifiziert und ordnungsgemäß dokumentiert von Roslin Zellen (UK). Schinken wurden unter …

Representative Results

Schinken enthalten eine Epithelschicht, die entfernt werden sollten, bevor die Aussaat von RPE-Zellen. Eine enzymatische Behandlung der Membran erfolgt mit dem Thermolysin unter schütteln. In der Reihenfolge nicht, nicht verlieren die Polarität der Membran (das Epithel ist auf einer Seite), es ist fixiert auf einem Träger, welche Zusammensetzung je nach Anbieter (Abbildung 1A) unterscheiden könnte. Überprüfen Sie die Adhäsion der Membran um seine Unter…

Discussion

Wir beschrieb eine Methode für die Kultur der RPE-Zellen auf eine biologische Gerüst und deren Vorbereitung für die Implantation in Tiermodellen. Einer der kritischen Schritte des Protokolls ist die Wartung der Orientierung des Schinkens entlang des Verfahrens bis zu seiner Aufnahme in Gelatine. In der Tat, das native Epithel der Membran entfernt, und die Basalmembran wird ausgesetzt⁹. Die RPE-Zellen müssen auf diese Basalmembran ausgesät werden. Bei der Vorbereitung für die Einbettung von G…

Materials

Sterile biosafety cabinet	TechGen International	Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration	Vacuubrand	BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator	Thermo Electron Corporation	BVC 21 NT
200 µL pipette: P200	Gilson	F144565
1 mL pipette: P1000	Gilson	F144566
Pipet aid	Drummond	75001
+4 °C refrigerator	Liebherr	Not applicable
Vibratome	Leica	VT1000S
Fine scissors	WPI	501758
Forceps (x2)	WPI	555227F
Water bath	Grant subaqua pro	SUB6
Precision balance	Sartorius	CP225D
Centrifuge	Eppendorff	5804
Microscope	Olympus	SC30
Horizontal Rocking Shaker	IKA-WERKE	IKA MTS 214D
Vortex	VWR	LAB DANCER S40
Disposable Scalpel	WPI	500351
plastic paraffin film	VWR	PM992
0.200 µm single use syringe filter	SARTORIUS	16532
Syringe without needle 50 mL	Dutscher	50012
Bottles 250mL	Dutscher	28024
15 mL sterile Falcon tubes	Dutscher	352097
50 mL sterile Falcon tubes	Dutscher	352098
culture insert	Scaffdex	C00001N
60 mm cell culture disches: B6	Dutscher	353004
12 well cell culture plate	Corning	3512
6-well culture plates	Corning	3506
Razor blades	Ted Pella, Inc	121-9
Cyanoacrylate glue	Castorama	3178040670105
PBS 1X (500 mL)	Sigma	D8537
Thermolysine	Roche	5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX	Invitrogen	61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)	Invitrogen	12618-013
MEM-NEAA (100X)	Invitrogen	11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM)	Invitrogen	31350-010
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140122
CO2-independent medium	GIBCO	18045-054
Gelatin	MERCK	104078
human amniotic membrane	Tissue bank St Louis hospital (Paris, France)	Not applicable