इंजीनियरिंग प्रत्यारोपण-उपयुक्त रेटिना वर्णक उपकला ऊतक मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न
Summary
हम मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं मानव एमनियोटिक झिल्ली के शीर्ष पर कल्चरित और पशु मॉडलों में भ्रष्टाचार के लिए अपनी तैयारी से व्युत्पंन रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं से बना एक रेटिना ऊतक इंजीनियर करने के लिए एक विधि का वर्णन ।
Abstract
नेत्र की कई रोग स्थितियों कार्यक्षमता और/या रेटिना वर्णक उपकला (RPE) के अस्तित्व को प्रभावित. ये रेटनाइटिस pigmentosa (आरपी) और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन (AMD) के कुछ रूपों में शामिल हैं । सेल थेरेपी सबसे होनहार चिकित्सकीय इन रोगों के इलाज के लिए प्रस्तावित रणनीतियों में से एक है, पहले से ही मनुष्य में प्रारंभिक परिणामों को बढ़ावा देने के साथ । हालांकि, भ्रष्टाचार की तैयारी की विधि vivo मेंउसके कार्यात्मक परिणामों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है । दरअसल, RPE कोशिकाओं एक सेल निलंबन के रूप में भ्रष्टाचारी एक ही कोशिकाओं एक रेटिना ऊतक के रूप में प्रत्यारोपित की तुलना में कम कार्यात्मक हैं. इस के साथ साथ, हम एक सरल और reproducible विधि का वर्णन करने के लिए इंजीनियर RPE ऊतक और इसकी तैयारी में एक के लिए vivo आरोपण. मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पंन RPE कोशिकाओं को एक जैविक समर्थन पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, मानव एमनियोटिक झिल्ली (हैम) । कृत्रिम पाड़ों की तुलना में, इस समर्थन एक तहखाने झिल्ली है कि Bruch की झिल्ली के करीब है जहां अंतर्जात RPE कोशिकाओं संलग्न कर रहे है होने का लाभ है । हालांकि, इसके हेरफेर आसान नहीं है, और हम vivo मेंभ्रष्टाचार के लिए अपनी उचित संवर्धन और तैयारी के लिए कई रणनीतियों का विकास किया ।
Introduction
RPE के अस्तित्व और photoreceptors के homeostasis के लिए महत्वपूर्ण है जिसके साथ यह कसकर जुड़ा हुआ है1. कई रोग की स्थिति आरपी और AMD सहित अपनी कार्यक्षमता और/
आरपी विरासत में मिला monogenic उत्परिवर्तनों कि photoreceptors या RPE कोशिकाओं या दोनों2,3के कार्यों को प्रभावित का एक समूह है । यह अनुमान है कि उत्परिवर्तनों कि विशेष रूप से प्रभावित RPE कोशिकाओं आरपी2के 5% के लिए खाते । AMD एक और शर्त है जहां RPE परत बदल गया है, केंद्रीय दृष्टि नुकसान के लिए अंततः अग्रणी । AMD आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों की जटिल बातचीत के कारण होता है और बुजुर्ग4,5,6को प्रभावित करता है । अनुमानों के अनुसार, AMD २०२०7द्वारा दुनिया भर में १९६,०००,००० रोगियों के लिए एक चिंता का विषय होगा । इन विकारों के लिए, कोई प्रभावी इलाज मौजूद है, और प्रस्तावित रणनीतियों में से एक है नई RPE कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए मर/कार्यात्मक मौजूदा RPE कोशिकाओं8।
अंतिम उत्पाद के निर्माण की विधा को भ्रष्टाचारित होना करने के लिए सबसे अच्छा कार्यात्मक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । RPE कोशिकाओं को एक सेल निलंबन के रूप में इंजेक्शन, प्रसव का एक आसान और सरल तरीका होने के बावजूद, उनके अस्तित्व, एकीकरण के बारे में चिंताओं को बढ़ा, और कार्यक्षमता9,10,11,12 , 13. वैज्ञानिकों अबऔर अधिक जटिल योगों इंजीनियर रेटिना ऊतक9,13,14,15,16देने के लिए विकसित कर रहे हैं । इस संदर्भ में, हम एक मूल विधि इन विट्रो RPE ऊतक कि प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में उत्पन्न करने के लिए विकसित9.
RPE सेल बैंकों मानव भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं से व्युत्पंन इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है । हालांकि, विभिंन सेल स्रोतों से वैकल्पिक RPE सेल बैंकों (मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल, प्राथमिक RPE कोशिकाओं, आदि) और एक अलग विधि के साथ विभेदित भी इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त हैं । यह साइटोकिंस और/या छोटे अणुओं17,18,19,20,21,22का उपयोग करते हुए भेदभाव प्रोटोकॉल निर्देशित शामिल हैं ।
प्रत्यारोपण किया जा करने के लिए, इंजीनियर ऊतक एक पाड़ पर तैयार किया जाना चाहिए । पिछले कुछ वर्षों में, विभिंन पाड़ों एक बहुलक के आधार पर या जैविक मूल के एक मैट्रिक्स पर विकसित किए गए13,23,24। यहाँ, जैविक सब्सट्रेट इस्तेमाल किया हैम है, लेकिन अन्य सब्सट्रेट, नंगा Bruch झिल्ली की तरह, लागू किया जा सकता है. यहां वर्णित विधि एक जैविक पाड़ है कि अधिक RPE देशी पर्यावरण के लिए प्रासंगिक है का उपयोग करने का लाभ है ।
मानव ES cell-व्युत्पन्न RPE कोशिकाओं को कम से 4 सप्ताह के लिए प्रसंस्कृत किया जाता है ताकि पूरी तरह से एक cobblestone monolayer के रूप में संगठित हो सके । उस चरण में, उपकला प्राप्त कार्यात्मक और ध्रुवीकरण9है. अंत में, इस ऊतक के रूप में आसानी से झुर्रियां, यह एक hydrogel वाहक की एक पतली परत में एंबेडेड इसे और अधिक कठोरता और लोच देने के लिए और इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान इसे बचाने के लिए है । यह उत्पाद तो 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है जब तक भ्रष्टाचार ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक जैविक पाड़ और पशु मॉडलों में आरोपण के लिए इसकी तैयारी पर RPE कोशिकाओं की संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन किया । प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम के एक सभी प्रक्रिया के साथ हैम के उंमुखीकरण के रखरखाव जब त?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक Jérôme Larghero और वैलेरी Vanneaux (Hôpital सेंट लुइस, पेरिस, फ्रांस) के लिए अपने इनपुट की स्थापना के दौरान यहां वर्णित विधि का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
यह काम ANR [GPiPS: ANR-२०१०-RFCS005 से अनुदान द्वारा समर्थित था; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], शौकीनों डाल ला सभ्य Médicale [जैव इंजीनियरिंग कार्यक्रम-DBS20140930777] और से LABEX पुनर्जीवित [ANR-10-LABX-७३] ओलिवर Goureau और Christelle Monville के लिए । यह NeurATRIS द्वारा समर्थित किया गया था, तंत्रिका विज्ञान में एक शोधों के लिए अनुवादात्मक अनुसंधान अवसंरचना (Investissements d’Avenir) [ANR-11-INBS-0011] और INGESTEM, राष्ट्रीय अवसंरचना (Investissements d’Avenir) इंजीनियरिंग के लिए pluripotent और विभेदित स्टेम कोशिकाएं [ANR-11-INBS-000] to Christelle Monville. करीम बेन M’Barek मंद Stempole और LABEX पुनर्जीवित [ANR-10-LABX-७३] से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । मैं स्टेम दुर्लभ रोग एसोसिएशन फ़्रांसेज़ contre लेस Myopathies (AFM)-Téléthon द्वारा समर्थित के लिए चिकित्सा संस्थान का हिस्सा है ।
Materials
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
Riferimenti
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration–emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M’Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M’Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet’s membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
