Engineering transplantasjon-passer netthinnens Pigment epitel vev avledet fra menneskelige embryonale stamceller
Summary
Vi beskriver en metode for å ingeniør en netthinnen vev består av netthinnens pigment epitelceller avledet fra menneskelige pluripotent stamceller kulturperler på menneskelig amniotic membraner og sin forberedelse til pode i dyremodeller.
Abstract
Flere pathological betingelser i øyet påvirker funksjonaliteten og/eller overlevelse av netthinnens pigment epitel (RPE). Disse inkluderer noen former for retinitis pigmentosa (RP) og aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Cellen terapi er en av de mest lovende strategiene foreslått å kurere disse sykdommer, med allerede oppmuntrende foreløpige resultater hos mennesker. Metode for utarbeidelse av graftet har imidlertid en betydelig innvirkning på sin funksjonelle resultater i vivo. RPE celler podet som en celle suspensjon er faktisk mindre funksjonell enn de samme cellene transplantert som en netthinnen vev. Her beskriver vi en enkel og reproduserbar metode for utvikling RPE vev og sin forberedelse for en i vivo implantasjon. RPE celler avledet fra menneskelige pluripotent stamceller er seeded på en biologisk støtte, menneskelige amniotic membranen (hAM). Sammenlignet med kunstig stillaser, har denne støtten fordelen av å ha en kjeller membran som er nær Bruchs membran hvor endogene RPE celler er festet. Men dens manipulasjon er ikke lett, og vi utviklet flere strategier for sin riktig dyrking og forberedelse til pode i vivo.
Introduction
RPE er avgjørende for overlevelse og homeostase av de fotoreseptorer som det er tett forbundet1. Flere pathological betingelser endre sin funksjonalitet eller overlevelse, inkludert RP og AMD.
RP er en gruppe av arvede monogenic mutasjoner som påvirker funksjonene til fotoreseptorer eller RPE celler eller begge2,3. Det anslås at mutasjoner som påvirker spesielt RPE celler utgjør 5% av RP2. AMD er en tilstand der RPE laget endres, ledende til slutt til sentrale synstap. AMD er forårsaket av komplekse samspillet av genetiske og miljømessige faktorer og påvirker de eldre4,5,6. Ifølge anslag, vil AMD være en bekymring for 196 millioner pasienter over hele verden av 20207. For disse lidelsene, ingen effektiv kur finnes, og en av strategiene foreslått er transplantasjon av nye RPE celler for å kompensere for død/nonfunctional forhåndseksisterende RPE celler8.
Modus for utformingen av det endelige produktet å bli podet er avgjørende for å sikre de beste funksjonelle resultatene. RPE cellene injisert som en celle suspensjon tross en enkel og grei metode for levering, heve bekymringer om deres overlevelse, integrering og funksjonaliteten9,10,11,12 , 13. forskere nå utvikler mer komplekse formuleringer å levere konstruert netthinnen vev,9,,13,,14,,15,,16. I denne sammenhengen utviklet vi en opprinnelige metoden for å generere i vitro RPE vev som kan brukes for transplantasjon9.
RPE cellen banker avledet fra menneskelig embryonic stem (ES) celler brukes i denne protokollen. Men alternativ RPE celle banker fra ulike celle kilder (menneskeskapte pluripotent stamceller, primære RPE celler, etc.) og differensiert med en annen metode passer også for denne protokollen. Det inkluderer rettet differensiering protokoller bruker cytokiner og/eller små molekyler17,18,19,20,21,22.
For å være transplantert, bør utviklet vevet være forberedt på et stillas. I de siste årene, ble ulike stillaser utviklet basert på en polymer eller en matrise av biologiske opphavet13,23,24. Her biologiske underlaget brukes er skinke, men andre underlag, som avdekt Bruch membraner, kan implementeres. Metoden beskrevet her har fordelen av benytter en biologisk skafottet som er mer relevant for RPE eget miljø.
Human ES celle-avledet RPE celler er kultivert i minst 4 uker for å være fullt organisert som en brosteinsbelagte monolayer. På det stadiet epitel innhentet fungerer og polarisert9. Til slutt, som dette vevet rynker lett, det er innebygd i et tynt lag av hydrogel bærer å gi det mer stivhet og elastisitet og beskytte det under innsetting prosedyren. Dette produktet lagres deretter på 4 ° C til pode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskrev en metode for kultur RPE celler på en biologisk stillaset og sin forberedelse til implantering i dyremodeller. En av de avgjørende skritt av protokollen er vedlikehold av retningen på hAM hele prosedyren til inkludering i gelatin. Faktisk innfødt epitel i membranen er fjernet og dens kjelleren membranen blir eksponert9. RPE cellene må være seeded på denne kjelleren membranen. Ved forberedelse til gelatin innebygging, er det avgjørende å jobbe med alle produkter på definerte te…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Jérôme Larghero og Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, Frankrike) for innspill deres under oppbyggingen av metoden beskrevet her.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Recherche Médicale [Bio-engineering program – DBS20140930777] og LABEX GJENOPPLIVE [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau og Christelle Monville. Det ble støttet av NeurATRIS, en translasjonsforskning infrastruktur (Investissements d’Avenir) for biotherapies i nevrovitenskap [ANR-11-INBS-0011] og INGESTEM, den nasjonale infrastrukturen (Investissements d’Avenir) engineering for pluripotent og differensiert stamceller [ANR-11-INBS-000] til Christelle Monville. Karim Ben M’Barek ble støttet av stipend fra DIM Stempole og LABEX GJENOPPLIVE [ANR-10-LABX-73]. -Stammen er en del av Biotherapies Institutt for sjeldne sykdommer støttes av Association Française contre les Myopathies (AFM)-Téléthon.
Materials
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
Riferimenti
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration–emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M’Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M’Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet’s membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
