Ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas

Summary

Se describe un método para diseñar un retineano tejido compuesto de células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de las células de vástago pluripotent humanas cultivadas sobre las membranas amnióticas humanas y su preparación para injerto en modelos animales.

Abstract

Varias condiciones patológicas del ojo afectan a la funcionalidad y la supervivencia del epitelio retiniano del pigmento (RPE). Estas son algunas formas de retinitis pigmentosa (RP) y degeneración macular senil (DMS). La terapia celular es una de las estrategias terapéuticas más prometedoras propuestas para curar estas enfermedades, con alentar ya resultados preliminares en seres humanos. Sin embargo, el método de preparación del injerto tiene un impacto significativo en sus resultados funcionales in vivo. De hecho, son menos funcionales que las misma células trasplantadas como un tejido retiniano células RPE injertadas como una suspensión. Adjunto, describimos un método simple y reproducible al ingeniero RPE tejido y su preparación para la implantación de una en vivo . Se siembran las células RPE derivadas de células madre pluripotentes humanas sobre un soporte biológico, la membrana amniótica humana (jamón). En comparación con andamios artificiales, este apoyo tiene la ventaja de tener una membrana del sótano que está cerca de donde se unen las células RPE endógenas la membrana de Bruch. Sin embargo, su manipulación no es fácil, y hemos desarrollado varias estrategias para su adecuado cultivo y preparación para injerto en vivo.

Introduction

RPE es crucial para la supervivencia y la homeostasis de los fotorreceptores con el cual está firmemente asociado¹. Varias condiciones patológicas alteran su funcionalidad y supervivencia, incluyendo RP y AMD.

RP es un grupo de mutaciones monogénicas hereditarias que afectan a las funciones de los fotorreceptores o las células RPE o ambos^2,3. Se estima que las mutaciones que afectan específicamente el RPE células representan el 5% de RP². AMD es otra condición donde se altera la capa RPE, pérdida de visión central en última instancia a líder. AMD es causado por las interacciones complejas de factores genéticos y ambientales y afecta a los ancianos^4,5,6. Según las proyecciones, AMD será un motivo de preocupación para pacientes 196 millones en todo el mundo por 2020⁷. Para estos trastornos, no hay cura efectiva existe, y una de las estrategias propuestas es el trasplante de nuevas células RPE para compensar muerto/no funcional preexistente de las células RPE⁸.

El modo de formulación de los productos finales a ser injertada es esencial para asegurar los mejores resultados funcionales. Células RPE inyectadas como una suspensión, a pesar de ser un método fácil y sencillo de entrega, plantear inquietudes acerca de su supervivencia, integración y funcionalidad^{9,10,11,12 , 13}. los científicos están preparando más formulaciones complejas para ofrecer ingeniería de tejido retiniano^{9,13,14,15,16}. En este contexto, hemos desarrollado un método original para generar el en vitro RPE tejido que podría ser utilizado para trasplante⁹.

Los bancos de células RPE derivados de células madre embrionarias humanas (ES) se utilizan en el presente Protocolo. Sin embargo, la alternativa RPE célula bancos procedentes de diferentes células (células madre pluripotentes humanas, las células RPE primarias, etc.) y distinguido con un método diferente también son adecuados para este protocolo. Incluye diferenciación dirigida protocolos con citoquinas y moléculas pequeñas^{17,18,19,20,21,22}.

Para ser trasplantado, el tejido diseñado debe estar preparado en un andamio. En los últimos años, diferentes andamios han desarrollado basado en un polímero o en una matriz de origen biológico^13,23,24. Aquí, el sustrato biológico utilizado es el jamón, pero otros substratos, como membranas de Bruch denudadas, podrían ser implementados. El método descrito en el presente documento tiene la ventaja de usar un andamio biológico más relevante para el entorno nativo de RPE.

Células madre derivadas de células RPE embrionarias humanas se cultivan durante al menos 4 semanas para completamente organizado como una monocapa de adoquines. En ese momento, el epitelio obtenido es funcional y polarizado⁹. Por último, como este tejido se arruga fácilmente, está incrustada en una capa delgada de un portador de hidrogel para darle más rigidez y elasticidad y para protegerlo durante el procedimiento de inyección. Este producto se almacena a 4 ° C hasta el injerto.

Protocol

Todos los materiales humanos utilizados en el presente Protocolo se utilizaron según regulaciones de la Unión Europea. La línea humana de la célula ES utilizada en este estudio se derivó de un embrión único. La pareja que había donado el embrión completamente fue informada y dio su consentimiento para una donación anónima. Una línea de células de humano ES de tipo clínico fue derivada de este embrión, bancarizada, calificada y debidamente documentada por la células de Roslin (Reino Unido). Jamones fueron …

Representative Results

Jamones contienen una capa epitelial que debe retirarse antes de la siembra de las células RPE. Un tratamiento enzimático de la membrana se realiza con el thermolysin bajo agitación. En orden no para no perder la polaridad de la membrana (el epitelio está en un lado), se fija en un soporte que composición puede ser diferente según el proveedor (figura 1A). Comprobar la adherencia de la membrana para su apoyo en este paso y añadir clips si es necesario….

Discussion

Hemos descrito un método para el cultivo de células RPE sobre un andamio biológico y su preparación para su implantación en modelos animales. Uno de los pasos críticos del protocolo es el mantenimiento de la orientación de la pieza a lo largo del procedimiento hasta su inclusión en gelatina. De hecho, se elimina el epitelio nativo de la membrana y su membrana basal se convierte expuestos⁹. Las células RPE deban ser sembrado en la cima de esta membrana del sótano. En preparación para inc…

Materials

Sterile biosafety cabinet	TechGen International	Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration	Vacuubrand	BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator	Thermo Electron Corporation	BVC 21 NT
200 µL pipette: P200	Gilson	F144565
1 mL pipette: P1000	Gilson	F144566
Pipet aid	Drummond	75001
+4 °C refrigerator	Liebherr	Not applicable
Vibratome	Leica	VT1000S
Fine scissors	WPI	501758
Forceps (x2)	WPI	555227F
Water bath	Grant subaqua pro	SUB6
Precision balance	Sartorius	CP225D
Centrifuge	Eppendorff	5804
Microscope	Olympus	SC30
Horizontal Rocking Shaker	IKA-WERKE	IKA MTS 214D
Vortex	VWR	LAB DANCER S40
Disposable Scalpel	WPI	500351
plastic paraffin film	VWR	PM992
0.200 µm single use syringe filter	SARTORIUS	16532
Syringe without needle 50 mL	Dutscher	50012
Bottles 250mL	Dutscher	28024
15 mL sterile Falcon tubes	Dutscher	352097
50 mL sterile Falcon tubes	Dutscher	352098
culture insert	Scaffdex	C00001N
60 mm cell culture disches: B6	Dutscher	353004
12 well cell culture plate	Corning	3512
6-well culture plates	Corning	3506
Razor blades	Ted Pella, Inc	121-9
Cyanoacrylate glue	Castorama	3178040670105
PBS 1X (500 mL)	Sigma	D8537
Thermolysine	Roche	5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX	Invitrogen	61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)	Invitrogen	12618-013
MEM-NEAA (100X)	Invitrogen	11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM)	Invitrogen	31350-010
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140122
CO2-independent medium	GIBCO	18045-054
Gelatin	MERCK	104078
human amniotic membrane	Tissue bank St Louis hospital (Paris, France)	Not applicable