Engineering Transplantation-lämplig Retinal Pigment epitel vävnad härrör från mänskliga embryonala stamceller
Summary
Vi beskriver en metod för att konstruera en retinala vävnaden består av näthinnans pigment epitelial celler från mänskliga pluripotenta stamceller odlade ovanpå mänskliga fostervatten membran och dess förberedelse för ympning i djurmodeller.
Abstract
Flera sjukdomstillstånd i ögat påverka funktionaliteten eller överlevnaden av retinal pigmentepitel (RPE). Dessa inkluderar vissa former av retinitis pigmentosa (RP) och åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Cellterapi är en av de mest lovande terapeutiska strategier föreslås att bota dessa sjukdomar, med redan uppmuntrande preliminära resultat hos människor. Metoden för beredning av graften har dock en betydande inverkan på dess funktionella utfall i vivo. RPE-celler som ympade som en cellsuspension är faktiskt mindre funktionell än samma celler transplanterade som en näthinnevävnad. Häri, beskriver vi en enkel och reproducerbar metod till ingenjör RPE vävnad och dess förberedelse för en in-vivo -implantation. RPE-celler som härrör från mänskliga pluripotenta stamceller är seedade på en biologisk stöd, mänskliga fostervatten membranet (hAM). Jämfört med konstgjorda byggnadsställningar, har detta stöd fördelen av att ha en basalmembranet som ligger nära den Bruchs membran där endogena RPE-celler är kopplade. Men dess behandlig är inte lätt och vi utvecklat flera strategier för dess korrekt odling och beredning för ympning i vivo.
Introduction
RPE är avgörande för överlevnad och homeostas av fotoreceptorer som det är tätt associerad1. Flera sjukdomstillstånd ändra dess funktionalitet och/eller överlevnad, inklusive RP och AMD.
RP är en grupp av ärvda monogena mutationer som påverkar funktionerna i fotoreceptorer, RPE-celler eller båda2,3. Det uppskattas att mutationer som påverkar särskilt RPE celler utgör 5% av RP2. AMD är ett annat tillstånd där RPE lagret ändras, ledande slutligen till centrala synbortfall. AMD orsakas av komplexa växelverkan av genetiska och miljömässiga faktorer och påverkar äldre4,5,6. Enligt prognoser kommer AMD vara ett bekymmer för 196 miljoner patienter över hela världen av 20207. För dessa störningar, något effektivt botemedel finns, och en av de strategier som föreslås är transplantation av nya RPE-celler för att kompensera för döda/nonfunctional redan existerande RPE celler8.
Formulering av den slutliga produkten att ympas är avgörande för att säkerställa bästa funktionella resultat. RPE-celler injiceras som en cellsuspension, trots att det är en lätt och okomplicerad metod för leverans, höja oro för deras överlevnad, integration och funktionalitet9,10,11,12 , 13. forskare utvecklar nu mer komplexa formuleringar att leverera konstruerad näthinnevävnad9,13,14,15,16. I detta sammanhang utvecklat vi en originell metod för att generera i vitro RPE vävnad som kan användas för transplantation9.
RPE cellbanker härrör från mänskliga embryonala stamceller (ES) används i detta protokoll. Dock alternativ RPE cell banker från olika cell källor (människans pluripotenta stamceller, primära RPE-celler, etc.) och differentierat med en annan metod är också lämpliga för detta protokoll. Det inkluderar riktad differentiering protokoll med hjälp av cytokiner och/eller små molekyler17,18,19,20,21,22.
För att kunna transplanteras, bör konstruerade vävnaden vara beredd på en byggnadsställning. I de senaste åren, har olika ställningar utvecklats på en polymer eller på en matris av biologiskt ursprung13,23,24. Här det biologiska substrat som används är skinka, men andra substrat, som utblottad Bruch membran, kunde genomföras. Den metod som beskrivs häri har fördelen med att använda en biologisk byggnadsställning som är mer relevant för RPE infödda miljön.
Mänskliga ES cell-derived RPE-celler odlas i minst 4 veckor för att vara fullt organiserade som en kullersten enskiktslager. I det skedet epitelet erhålls är funktionell och polariserade9. Slutligen, eftersom denna vävnad rynkor lätt, den är inbäddad i ett tunt lager av hydrogel bärare att ge det mer styvhet och elasticitet och skydda den under förfarandet för injektion. Denna produkt är sedan lagras vid 4 ° C tills ympning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskrivs en metod för kulturen i RPE-celler på en biologisk byggnadsställning och dess förberedelser för implantation i djurmodeller. En av de kritiska steg i protokollet är underhåll av orientering på skinkan längs förfarandet fram till dess införande i gelatin. Faktiskt det infödda epitelet av membranet tas bort och dess basalmembranet blir exponerade9. RPE-cellerna måste vara seedad ovanpå detta basalmembranet. Vid förberedelse för gelatin inbäddning, är det viktigt att arb…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Jérôme Larghero och Valérie Vanneaux (Hôpital Saint-Louis, Paris, Frankrike) för deras insatser under inrättandet av den metod som beskrivs här.
Detta arbete stöds av bidrag från ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Recherche Médicale [Bio-engineering program – DBS20140930777] och från LABEX ÅTERUPPLIVA [ANR-10-LABX-73] att Olivier Goureau och Christelle Monville. Den stöddes av NeurATRIS, en translationell forskningsinfrastruktur (Investissements pris) för bioterapier i neurovetenskap [ANR-11-INBS-0011] och INGESTEM, den nationella infrastrukturen (Investissements pris) engineering för pluripotenta och differentierade stamceller [ANR-11-INBS-000] till Christelle Monville. Karim Ben M’Barek stöddes av stipendier från DIM Stempole och LABEX ÅTERUPPLIVA [ANR-10-LABX-73]. Jag-stammen är en del av det bioterapier Institutet för sällsynta sjukdomar som stöds av den Association Française contre les myopatier (AFM)-Téléthon.
Materials
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
Riferimenti
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration–emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M’Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M’Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet’s membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
