Ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane

Summary

Descriviamo un metodo per progettare un tessuto retinico composto di cellule epiteliali del pigmento retinico derivate da cellule staminali pluripotenti umane coltivate in cima membrane amniotiche umane e la sua preparazione per l’innesto in modelli animali.

Abstract

Diverse condizioni patologiche dell’occhio influenzano la funzionalità e/o la sopravvivenza dell’epitelio retinico del pigmento (RPE). Questi includono alcune forme di retinite pigmentosa (RP) e degenerazione maculare senile (AMD). Terapia cellulare è una delle più promettenti strategie terapeutiche proposte per curare queste malattie, con già incoraggianti risultati preliminari in esseri umani. Tuttavia, il metodo di preparazione dell’innesto ha un impatto significativo su suoi esiti funzionali in vivo. Infatti, le cellule RPE innestate come una sospensione cellulare sono meno funzionale le stesse cellule trapiantate come un tessuto retinico. Qui, descriviamo un metodo semplice e riproducibile per ingegnere RPE tessuto e la sua preparazione per un impianto in vivo . Cellule RPE derivate da cellule staminali pluripotenti umane sono seminate su un supporto biologico, la membrana amniotica umana (prosciutto). Rispetto ai ponteggi artificiale, questo supporto ha il vantaggio di avere una membrana dello scantinato che è vicino alla membrana di Bruch cui cellule RPE endogene sono fissate. Tuttavia, la sua manipolazione non è facile, e abbiamo sviluppato diverse strategie per la sua corretta coltivazione e preparazione per l’innesto in vivo.

Introduction

RPE è cruciale per la sopravvivenza e l’omeostasi dei fotorecettori con cui è strettamente associato¹. Diverse condizioni patologiche alterano la funzionalità e/o sopravvivenza, comprese la RP e AMD.

RP è un gruppo di mutazioni monogeniche ereditarie che colpiscono le funzioni di fotorecettori, cellule RPE o entrambi di^2,3. Si stima che le mutazioni che interessano specificamente RPE cellule rappresentano il 5% di RP². AMD è un’altra condizione dove lo strato RPE è alterato, leader perdita di visione in definitiva a centrale. AMD è causato da complesse interazioni di fattori genetici e ambientali e colpisce gli anziani^4,5,6. Secondo le proiezioni, AMD sarà una preoccupazione per 196 milioni di pazienti nel mondo da 2020⁷. Per questi disturbi, non esiste alcuna cura efficace, e una delle strategie proposte è il trapianto di nuove cellule RPE per compensare i morti/non funzionale preesistente di cellule RPE⁸.

La modalità di formulazione del prodotto finale per essere innestato è essenziale per garantire i migliori risultati funzionali. Le cellule RPE iniettate come una sospensione cellulare, pur essendo un metodo di consegna, facile e semplice sollevano preoccupazioni per quanto riguarda la loro sopravvivenza, integrazione e funzionalità^{9,10,11,12 , 13}. gli scienziati ora stanno sviluppando più complesse formulazioni di consegnare ingegnerizzato tessuto retinico^{9,13,14,15,16}. In questo contesto, abbiamo sviluppato un metodo originale per generare in vitro tessuto RPE che poteva essere utilizzato per il trapianto⁹.

Banche di cellule RPE derivate da cellule staminali embrionali umane (ES) sono utilizzate nel presente protocollo. Comunque, alternativa RPE cellula banche da fonti differenti delle cellule (cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo, cellule RPE primarie, ecc.) e differenziato con un metodo diverso sono adatti anche per questo protocollo. Esso comprende differenziazione diretto protocolli mediante citochine e/o piccole molecole^{17,18,19,20,21,22}.

Per essere trapiantati, il tessuto ingegnerizzato dovrebbe essere preparato su un ponteggio. Negli ultimi anni, diversi ponteggi sono stati sviluppati basandosi su un polimero o su una matrice di origine biologica^13,23,24. Qui, il substrato biologico utilizzato è il prosciutto, ma altri substrati, come membrane Bruch denudate, potrebbero essere attuate. Il metodo qui descritto ha il vantaggio di usando un’impalcatura biologica che è più rilevante per l’ambiente nativo di RPE.

Cellule RPE di derivati da cellule ES umane sono coltivate per almeno 4 settimane al fine di essere completamente organizzato come un monostrato di ciottoli. In tale fase, l’epitelio ottenuta è funzionale e polarizzato⁹. Infine, come questo tessuto rughe facilmente, è incorporato in uno strato sottile di un vettore di idrogel per dargli più rigidità ed elasticità e per proteggerlo durante la procedura di iniezione. Questo prodotto è quindi conservato a 4 ° C fino ad innesto.

Protocol

Tutto il materiale umano utilizzato in questo protocollo sono stato utilizzato in conformità con i regolamenti dell’Unione europea. La linea cellulare umana di ES utilizzata in questo studio è stata derivata da un unico embrione. La coppia che aveva donato l’embrione è stato pienamente informata e hanno dato il loro consenso per una donazione anonima. Una linea cellulare di uso clinico umana ES è stata derivata da questo embrione, incassata, qualificata e adeguatamente documentata da Roslin cellule (UK). Prosciutti s…

Representative Results

Prosciutti contengono uno strato epiteliale che deve essere rimossi prima della semina delle cellule RPE. Un trattamento enzimatico della membrana viene eseguito con la termolisina sotto agitazione. In ordine di non perdere la polarità della membrana (l’epitelio è su un lato), è fissato su un supporto quale composizione potrebbe essere diversa a seconda del provider (Figura 1A). L’adesione della membrana al suo sostegno in questa fase di verifica e se nece…

Discussion

Abbiamo descritto un metodo per la coltura di cellule RPE su un’impalcatura biologica e la sua preparazione per l’impianto in modelli animali. Una delle fasi critiche del protocollo è il mantenimento dell’orientamento del prosciutto lungo tutta la procedura fino alla sua inclusione in gelatina. Infatti, viene rimosso l’epitelio nativo della membrana e relativa membrana dello scantinato diventa esposto⁹. Le cellule RPE devono essere seminati in cima a questa membrana dello scantinato. Al momento d…

Materials

Sterile biosafety cabinet	TechGen International	Not applicable
Liquid waste disposal system for aspiration	Vacuubrand	BVC 21
CO2-controlled +37 °C cell incubator	Thermo Electron Corporation	BVC 21 NT
200 µL pipette: P200	Gilson	F144565
1 mL pipette: P1000	Gilson	F144566
Pipet aid	Drummond	75001
+4 °C refrigerator	Liebherr	Not applicable
Vibratome	Leica	VT1000S
Fine scissors	WPI	501758
Forceps (x2)	WPI	555227F
Water bath	Grant subaqua pro	SUB6
Precision balance	Sartorius	CP225D
Centrifuge	Eppendorff	5804
Microscope	Olympus	SC30
Horizontal Rocking Shaker	IKA-WERKE	IKA MTS 214D
Vortex	VWR	LAB DANCER S40
Disposable Scalpel	WPI	500351
plastic paraffin film	VWR	PM992
0.200 µm single use syringe filter	SARTORIUS	16532
Syringe without needle 50 mL	Dutscher	50012
Bottles 250mL	Dutscher	28024
15 mL sterile Falcon tubes	Dutscher	352097
50 mL sterile Falcon tubes	Dutscher	352098
culture insert	Scaffdex	C00001N
60 mm cell culture disches: B6	Dutscher	353004
12 well cell culture plate	Corning	3512
6-well culture plates	Corning	3506
Razor blades	Ted Pella, Inc	121-9
Cyanoacrylate glue	Castorama	3178040670105
PBS 1X (500 mL)	Sigma	D8537
Thermolysine	Roche	5339880001
DMEM, high glucose, GlutaMAX	Invitrogen	61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)	Invitrogen	12618-013
MEM-NEAA (100X)	Invitrogen	11140-035
b-mercaptoethanol (50 mM)	Invitrogen	31350-010
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140122
CO2-independent medium	GIBCO	18045-054
Gelatin	MERCK	104078
human amniotic membrane	Tissue bank St Louis hospital (Paris, France)	Not applicable