تكوين الأعصاب باستخدام خلايا سرطان الجنين P19
Summary
يستخدم خط الخلايا السرطانية الجنينية P19 (خط الخلية P19) على نطاق واسع لدراسة الآلية الجزيئية للتكوين العصبي مع تبسيط كبير بالمقارنة مع تحليل في الجسم الحي. هنا، نقدم بروتوكول ًا للتكوين العصبي الناجم عن حمض الريتينويك في خط الخلية P19.
Abstract
خط الخلية P19 المستمدة من سرطان التراتوسرطان الفأر المستمدة من الأجنة لديه القدرة على التمييز في الطبقات الجرثومية الثلاث. في وجود حمض الريتينويك (RA)، يتم حث خط الخلية P19 المعلق المستزرع للتمييز في الخلايا العصبية. يتم التحقيق في هذه الظاهرة على نطاق واسع كنموذج تكوين الأعصاب في المختبر. ولذلك، فإن خط الخلية P19 مفيد جدا للدراسات الجزيئية والخلوية المرتبطة تكوين الأعصاب. ومع ذلك، بروتوكولات للتمايز العصبية من خط الخلية P19 الموصوفة في الأدب معقدة جداً. الطريقة التي وضعت في هذه الدراسة بسيطة وسوف تلعب دورا في توضيح الآليات الجزيئية في تشوهات النمو العصبي والأمراض العصبية التنكسية.
Introduction
أثناء النمو الجنيني، يتم تحويل طبقة خليةواحدة إلى ثلاث طبقات جرثومية منفصلة 1،2،3. ولزيادة إمكانيات البحث عن الظواهر التي تحدث في الجسم الحي، تم تطوير توليد المجاميع ثلاثية الأبعاد (الأجسام الجنينية) كنموذج ملائم. المجاميع الخلوية التي تتشكل بهذه الطريقة يمكن أن تتعرض لظروف مختلفة تسبب تمايز الخلايا، والتي تعكس تطور الجنين4،5. يستخدم خط الخلايا السرطانية الجنينية P19 murine (خط الخلية P19) عادة كنموذج خلوي لدراسات تكوين الأعصاب في المختبر6و7و8. يعرض خط الخلية P19 ميزات الخلايا الجذعية متعددة القوى النموذجية ويمكن أن تميز في الخلايا العصبية في وجود حمض الريتينويك (RA) أثناء تجميع الخلايا تليها نمو النيورايت في ظل ظروف الالتزام. وعلاوة على ذلك، فإن خط الخلية P19 غير المتمايزة قادر أيضا على تشكيل خلايا تشبه العضلات وعضلة القلب تحت تأثير كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO)9،10،11،12.
وقد تم الإبلاغ عن العديد من الطرق13،14،15،16 للتمايز العصبية ، ولكن المنهجية معقدة في بعض الأحيان وليس من السهل فهمها من خلال قراءة الأوصاف فقط. على سبيل المثال، تتطلب البروتوكولات في بعض الأحيان مزيجًا من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco (DMEM) المكمّل بمزيج من مصل العجل (CS) ومصل البقر الجنيني (FBS)13. وعلاوة على ذلك، غالبا ما تتكون وسائل الإعلام المستخدمة لتطوير الخلايا العصبية من المكملات العصبية وB2713،14،15،16. وعلى هذا النحو، فإن الأساليب القائمة تنطوي على تعقيد في إعدادها، وهدفنا هنا هو تبسيط البروتوكولات. في هذه الدراسة، أظهرنا أن DMEM مع FBS يمكن استخدامها للحفاظ على خط الخلية P19 (DMEM + 10٪ FBS) وكذلك لتطوير الخلايا العصبية (DMEM + 5٪ FBS + RA). هذه الطريقة المبسطة للتكوين العصبي باستخدام خط الخلية P19 يسمح لنا لدراسة الآلية الجزيئية لكيفية تطوير الخلايا العصبية. وعلاوة على ذلك، يتم إجراء البحوث على الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر أيضا باستخدام خط الخلية P1917،18، ونعتقد أن الطريقة التي وضعت في هذه الدراسة سوف تلعب دورا في توضيح الآليات الجزيئية في تشوهات النمو العصبي والأمراض العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، ونحن نصف بروتوكول بسيط لتكوين الأعصاب باستخدام خط الخلية P19. على الرغم من أن العديد من التقارير قد نشرت في هذا الصدد، لا تزال منهجية مفصلة للتحريض تكوين الأعصاب باستخدام خط الخلية P19 غير واضحة. وعلاوة على ذلك، استخدمنا الجلوكوز عالية بسيطة (4500 ملغ / لتر) DMEM المتوسطة مع 10٪ FBS للتجربة بأكم?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وحظيت الدراسة بدعم مالي من المركز الوطني للعلوم في بولندا (منحة رقم. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) وKNOW (مركز البحوث الوطنية الرائدة) الاتحاد العلمي “صحة الحيوان – الغذاء الآمن”، قرار وزارة العلوم والتعليم العالي رقم 05-1/KNOW2/2015
Materials
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
Riferimenti
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488 (2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).
- Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Biologia dello sviluppo. 371 (2), 170-179 (2012).
- ten Berge, D., et al. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway. Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).
- Lin, Y. T., et al. YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway. Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).
- Neo, W. H., et al. MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression. Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).
- Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
- McBurney, M. W., Rogers, B. J. Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns. Biologia dello sviluppo. 89 (2), 503-508 (1982).
- Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).
- Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells. Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).
- Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity. Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).
- Babuska, V., et al. Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation. Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).
- Monzo, H. J., et al. A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells. Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).
- Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity. BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).
- Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells. Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).
- Tsukane, M., Yamauchi, T. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).
- Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation. Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).
- Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
- Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).
- Hamada-Kanazawa, M., et al. Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid. FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).
- Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons. Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).
- Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters. Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).
- MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neuroscienze. 80 (2), 487-499 (1997).
- Hong, S., et al. Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).
- Wenzel, M., et al. Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells. FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).
- Harada, Y., et al. Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).
- Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum. Neuroscienze. 58 (4), 753-763 (1994).
- Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line. Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).
