Neurogenesi con cellule carcinoma embrionale P19
Summary
La linea cellulare del carcinoma embrionale del topo P19 (linea cellulare P19) è ampiamente utilizzata per studiare il meccanismo molecolare della neurogenesi con grande semplificazione rispetto all’analisi in vivo. Qui, presentiamo un protocollo per la neurogenesi indotta da acido retinoico nella linea cellulare P19.
Abstract
La linea cellulare P19 derivata da un teratocarcinoma derivato da un embrione di topo ha la capacità di differenziarsi nei tre strati germinali. In presenza di acido retinoico (RA), la linea cellulare P19 coltivata in sospensione è indotta a differenziarsi in neuroni. Questo fenomeno è ampiamente studiato come un modello di neurogenesi in vitro. Pertanto, la linea cellulare P19 è molto utile per gli studi molecolari e cellulari associati alla neurogenesi. Tuttavia, i protocolli per la differenziazione neuronale della linea cellulare P19 descritti nella letteratura sono molto complessi. Il metodo sviluppato in questo studio è semplice e giocherà un ruolo nel chiarire i meccanismi molecolari nelle anomalie del neurosviluppo e nelle malattie neurodegenerative.
Introduction
Durante lo sviluppo embrionale, uno strato a cella singola viene trasformato in tre strati germinali separati1,2,3. Per aumentare le possibilità di ricerca dei fenomeni che si verificano in vivo, la generazione di aggregati tridimensionali (corpi embrionali) è stata sviluppata come un modello conveniente. Gli aggregati cellulari formati in questo modo possono essere esposti a varie condizioni causando differenziazione cellulare, che riflettono lo sviluppo dell’embrione4,5. La linea cellulare p19 murina carcinoma embrionale (linea cellulare P19) è comunemente usata come modello cellulare per studi di neurogenesi in vitro6,7,8. La linea cellulare P19 presenta le caratteristiche tipiche delle cellule staminali pluripotenti e può differenziarsi in neuroni in presenza di acido retinoico (RA) durante l’aggregazione cellulare seguita da escrescenza neurite in condizioni aderenti. Inoltre, la linea cellulare P19 indifferenziata è anche in grado di formare cellule muscolo-e cardiomiociti-come sotto l’influenza di solforo dimetilo (DMSO)9,10,11,12.
Molti metodi13,14,15,16 sono stati segnalati per la differenziazione neuronale, ma la metodologia è a volte complicata e non facile da comprendere leggendo solo le descrizioni. Ad esempio, i protocolli a volte richiedono una combinazione del mezzo DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco,minedante, integrato con una miscela di siero di vitello (CS) e siero bovino fetale (FBS)13. Inoltre, i media utilizzati per lo sviluppo neuronale sono spesso composti da Neurobasal e B27 integratori13,14,15,16. Come tale, i metodi esistenti contengono complessità nella loro preparazione e il nostro obiettivo qui è quello di semplificare i protocolli. In questo studio, abbiamo dimostrato che DMEM con FBS può essere utilizzato per mantenere la linea cellulare P19 (DMEM – 10% FBS) così come per lo sviluppo neuronale (DMEM – 5% FBS – RA). Questo metodo semplificato per la neurogenesi utilizzando la linea cellulare P19 ci permette di studiare il meccanismo molecolare di come vengono sviluppati i neuroni. Inoltre, la ricerca sulle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer è condotta anche utilizzando la linea cellulare P1917,18, e crediamo che il metodo sviluppato in questo studio giocherà un ruolo nel chiarire il meccanismi molecolari nelle anomalie del neurosviluppo e nelle malattie neurodegenerative.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un semplice protocollo per la neurogenesi usando la linea cellulare P19. Anche se molti rapporti sono stati pubblicati a questo proposito, una metodologia dettagliata per l’induzione della neurogenesi utilizzando la linea cellulare P19 rimane poco chiara. Inoltre, abbiamo utilizzato un semplice mezzo DMEM ad alto glucosio (4.500 mg/L) con 10% FBS per l’intero esperimento. Questo ci ha permesso di eseguire l’esperimento neurogenico in modo user-friendly ed espandere l’uso di questo metodo per il futuro.</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto finanziariamente dal Centro nazionale di scienze, Polonia (n. di sovvenzione. UMO-2017/25/N/N/N-N/3/01886) e KNOW (Leading National Research Centre) Consorzio scientifico “Animale sano – Cibo sicuro”, decisione del Ministero della Scienza e dell’Istruzione Superiore n. 05-1/KNOW2/2015
Materials
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
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