Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen
Summary
Mechanosensitive Ionenkanäle sind oft in Bezug auf Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit mit Patch-Clamp-Aufnahme untersucht. Allerdings kann je nach experimentellen Protokoll, das Ergebnis auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen fehlerhaft sein. Hier bieten wir Methoden zur Vermeidung und Korrektur solcher Fehler mit einer theoretischen Grundlage.
Abstract
Strömung ist ein wichtiger ökologischer Impuls, der viele physiologische und pathologische Prozesse, wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation steuert. Obwohl die molekularen Mechanismen der biologischen Reaktionen auf Fluid Flow/Querkraft nicht vollständig verstanden sind, kann kritisch Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating beitragen. Daher wurde Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit Ionenkanäle mit der Patch-Clamp-Technik untersucht. Jedoch können abhängig von den experimentellen Protokoll die Ergebnisse und Interpretation der Daten fehlerhaft sein. Hier präsentieren wir experimentelle und theoretische Belege für Fluid Flow-bezogene Fehler und Methoden für die Schätzung, Vorbeugung und Korrektur dieser Fehler bereitzustellen. Veränderungen der Kreuzung Potenzial zwischen Ag/AgCl-Referenzelektrode und Baden Flüssigkeit wurden gemessen mit einer offenen Pipette gefüllt mit 3 M KCl. Strömung konnte dann die Flüssigmetall/Kreuzung Potenzial für ca. 7 mV zu verlagern. Im Gegensatz dazu durch die Messung der Spannung-Verschiebung durch Strömung induzierte, schätzten wir die Ionenkonzentration in der ungerührte Grenzschicht. Im statischen Zustand erreichen die echte Ionenkonzentrationen angrenzend an den Ag/AgCl Referenz Elektrode oder Ionen-Kanal Einlass an der Zellmembran Oberfläche so niedrig wie etwa 30 % davon in den Flow-Zustand. Platzieren einer Agarose 3 M kann KCl-Brücke zwischen der Baden-Flüssigkeit und Referenz-Elektrode dieses Problem der Kreuzung mögliche Verschiebung verhindert. Das ungerührte Ebeneneffekt angrenzend an der Oberfläche der Zellmembran konnten jedoch nicht auf diese Weise gelöst werden. Hier bieten wir eine Methode zur Messung der realen Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette, betonend, wie wichtig es ist, mit einer Agarose Salz-Brücke während des Studiums Fluid strömungsinduzierte Verordnung von Ionen strömen. Daher kann dieser neuartige Ansatz, unter Berücksichtigung der realen Konzentrationen von Ionen in der ungerührte Grenzschicht, nützlichen Einblick auf die experimentelle Gestaltung und Interpretation der Daten im Zusammenhang mit Fluid Schubspannung Regulierung von Ionenkanälen bereitstellen .
Introduction
Strömung ist eine wichtige ökologische Cue, die vielen physiologische und pathologische Prozessen wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation und Flüssigkeit Scherkräfte Kraft-abhängige Gefäße Umgestaltung und Entwicklung1,2steuert, 3,4,5. Obwohl die molekularen Mechanismen für die biologischen Reaktionen auf Flüssigkeitsströmung Querkraft nicht vollständig verstanden sind, wird angenommen, dass Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating kritisch zur Fluid strömungsinduzierte Antworten5 beitragen können , 6 , 7 , 8. Z. B. Aktivierung von Endothelzellen nach innen Gleichrichter Kir2.1 und Ca2 +-aktivierte K+ (KCa2,3, KCNN3) Kanäle nach Ca2 + Zustrom von Flüssigkeitsströmung vorgeschlagen worden ist, beizutragen zur Flüssigkeit strömungsinduzierte Vasodilatation6,7,8. Daher viele Ionenkanäle, vor allem mechanisch aktiviert oder -gehemmte Kanäle wurden untersucht im Hinblick auf die Kraftempfindlichkeit Fluid Flow/Scherung mit der Patch-Clamp Technik6,9,10 , 11. abhängig vom experimentellen Protokoll während Patch-Clamp-Aufnahme durchgeführt, Ergebnisse und Interpretation der Daten auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen können jedoch fehlerhafte10,11.
Eine Quelle der Flüssigkeit strömungsinduzierte Artefakte in der Patch-Clamp-Aufnahme ist aus der Kreuzung zwischen der Badflüssigkeit und Ag/AgCl Referenz-Elektrode11möglichen. Es wird allgemein angenommen, dass die Flüssigmetall/Kreuzung Potenzial zwischen Baden Fluid und Ag/AgCl Elektroden konstant ist wie die Cl– -Konzentration der Flüssigkeit Baden konstant gehalten, ist unter Berücksichtigung der chemischen Reaktion zwischen der Baden-Lösung und Ag/AgCl-Elektrode zu werden:
AG + Cl–↔ AgCl + Elektron (e–) (Gleichung 1)
Jedoch in einem Fall, wo die insgesamt elektrochemische Reaktion zwischen dem Baden Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode (Gleichung 1) von links nach rechts verläuft, verweisen die Cl– -Konzentration der Baden Flüssigkeit neben der Ag/AgCl Elektrode (ungerührte Grenzschicht12,13,14,15) möglicherweise viel geringer als die in der Masse der Lösung, Baden, sofern genügend Konvektion Transport gewährleistet ist. Mit einer alten oder nicht-ideale Ag/AgCl-Elektrode mit unzureichenden Chlorierung der Ag kann dieses Risiko erhöhen. Dieses Fluid Flow-bezogene Artefakt an der Referenzelektrode, in der Tat kann ausgeschlossen werden, indem Sie einfach eine herkömmliche Agarose-Salz-Brücke zwischen Baden Fluid und Referenz Elektrode, da das Artefakt auf Veränderungen im realen Cl– Angrenzend an die Ag/AgCl-Elektrode11Konzentration. Das Protokoll in dieser Studie vorgestellt beschreibt die verhindern, dass die Junction Flow-im Zusammenhang mit möglichen Änderungen und echte Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht zu messen.
Nach dem Platzieren einer Agarose KCl-Brücke zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl-Referenzelektrode, ist ein weiterer entscheidender Faktor, der berücksichtigt werden sollte: nur als Referenz Ag/AgCl-Elektrode wirkt wie ein Cl– -Elektrode, die Ionenkanäle auch funktionieren können wie eine ionenselektive Elektrode. Die Situation der eine ungerührte Grenzschicht zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl-Referenzelektrode entsteht während der Bewegung der Ionen zwischen den extrazellulären und intrazellulären Lösungen durch die Membran-Ionenkanäle. Dies impliziert, dass Vorsicht bei Auslegung der Verordnung von Ionen durch Flüssigkeitsströmung Kanäle verwendet werden soll. Wie in unserer vorherigen Studie11besprochen, die Bewegung von Ionen durch eine Lösung, in denen eine elektrochemische Steigung vorliegt, kann auftreten, über drei verschiedene Mechanismen: Diffusion, Migration und Konvektion, wo Diffusion die Bewegung ist induziert durch Konzentrationsgradienten, Migration ist die Bewegung von elektrischen Gradienten angetrieben und Konvektion ist die Bewegung durch Fluid-Flow. Unter diesen drei Transportmechanismen trägt Konvektion-Modus die meisten um die Bewegung von Ionen11 (> 1.000 Mal größer als Diffusion oder Migration unter üblichen Patch-Clamp-Einstellungen). Dies bildet die theoretische Basis warum Kreuzung Potenzial zwischen Baden Fluid und Ag/AgCl-Referenzelektrode sehr unter verschiedenen statischen und Fluid-Flow Bedingungen11kann.
Gemäß der Hypothese oben vorgeschlagen, einige facilitatory Effekte der Strömung auf die aktuellen Ionenkanal können entnommen werden die konvektive Wiederherstellung der realen Ionenkonzentrationen angrenzend an die Kanal-Einlass an der Membranoberfläche (ungerührte Grenzschicht) 10. In diesem Fall die strömungsinduzierte Effekte von Flüssigkeiten auf Ionen-Kanal Strömungen entstanden einfach aus elektrochemischen Ereignisse nicht von der Regelung der Ionen-Kanal gating. Eine ähnliche Idee wurde zuvor von Barry und Kollegen12,13,14,15 basierend auf strengen theoretischen Überlegungen und experimentelle Beweise, auch bekannt als die ungerührte Schicht vorgeschlagen oder Transport-Nummer-Effekt. Wenn einige Ionenkanäle genügend auftreten Einkanal-Leitfähigkeit und lange genug offene Zeit, ausreichend Transport Preise durch die Kanäle (Transport schneller in der Membran als in der ungerührte Membranoberfläche), einen Grenzschicht-Effekt zur Verfügung zu . So kann die Konvektion-abhängige Transport zum eventuellen Flüssigkeit-strömungsinduzierte Erleichterungen von Ionen-aktuelle10,12,13,14,15beitragen.
In dieser Studie betonen wir, wie wichtig es ist, mit einem Agar oder Agarose Salz-Brücke während des Studiums Flüssigkeit-strömungsinduzierte Verordnung von Ionen strömen. Wir bieten auch eine Methode zur Messung der realen Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht angrenzend an die Ag/AgCl Referenz-Elektrode und Membran Ionenkanäle. Darüber hinaus bieten die theoretische Interpretation der Flüssigkeit strömungsinduzierte Modulation der Ionen-Kanal Ströme (z. B. Konvektion Hypothese oder ungerührte Transport Nummer Ebeneneffekt) wertvolle Erkenntnisse für die Gestaltung und Interpretation von Studien auf die Scherung Kraftregelung von Ionenkanälen. Nach dem ungerührte Grenzschicht Transport Nummer Effekt sagen wir voraus, dass Ionen-Kanal Ströme durch alle Arten von Ionenkanälen Membran durch Flüssigkeitsströmung, unabhängig von ihrer biologischen Empfindlichkeit gegenüber Flüssigkeitsströmung Querkraft, aber nur wenn gefördert werden kann die Ionenkanäle haben ausreichende Einkanal-Leitfähigkeit und lange offene Zeit. Höheren Stromdichten der Ionen-Kanal kann die ungerührte Grenzschicht Wirkung an der Oberfläche der Zellmembran erhöhen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir eine Methode, um echte Cl– -Konzentration in der ungerührte Schicht angrenzend an die Ag/AgCl-Referenzelektrode messen durch die Bestimmung der potentiellen Flüssigmetall-Kreuzung mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette gefüllt mit einem hohen KCl gezeigt. Konzentration. Die Veränderung der Cl– -Konzentration in der Grenzschicht führt zu einer Verschiebung der Kreuzung Potenzial beim Wechsel von statischen zu Flüssigkeit Strömungsverhältnisse. Einfach mit einer A…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch den Pionier Research Center Program (2011-0027921), von Basic Science Research Programme (2015R1C1A1A02036887 und NRF-2016R1A2B4014795 durch die National Research Foundation of Korea gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT) unterstützt. & Zukunft planen, und durch einen Zuschuss der Korea Health Technology R & D Projekt durch Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziert durch das Ministerium für Gesundheit & Wohlbefinden, Republik Korea (HI15C1540).
Materials
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
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