Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi
Summary
Burada amiloid-β (Aβ) beyindeki erken etkilerini araştırmak için bir protokol sunulmuştur. Bu Aβ clathrin aracılı endositoz ve aksonal büyüme koniler çöküşü indükler gösterir. İletişim kuralı erken etkileri Aβ aksonal büyüme koniler okumak yararlı ve Alzheimer hastalığı önleme kolaylaştırabilir.
Abstract
Amiloid-β (Aβ) bellek bozuklukları Alzheimer hastalığı içinde (Ah) neden olur. Tedavi gösterilen rağmen reklam hastaların beynindeki Aβ düzeyleri azaltmak için bunlar hafıza fonksiyonları geliştirmek değil. Bellek bozuklukları görünümünü önce beyinde Aβ toplar beri Aβ hedefleme zaten bellek açıkları sergileyen reklam hastaları tedavi etmek için verimsiz olabilir. Bu nedenle, aşağı akım Aβ birikimi nedeniyle sinyal reklam geliştirme önce engellenmelidir. Aβ aksonal dejenerasyon, nöronal ağlar ve bellek bozuklukları kesintiye uğraması için önde gelen neden olmaktadır. Aβ toksisite mekanizmalar üzerinde birçok çalışma olmasına rağmen kaynak Aβ toksisitesi bilinmemektedir. Kaynağını belirlemeye yardımcı olması için mikroskopi, gen transfection ve canlı hücre tarafından Aβ kültürlü nöronların aksonal büyüme koni içinde neden erken değişiklikleri öğrenmek için Imaging kullanan yeni bir iletişim kuralı öneriyoruz. Bu iletişim kuralı Aβ endositoz inhibisyonu Aβ toksisite engel olduğunu gösteren clathrin aracılı endositoz büyüme koni çöküntü, takip aksonal büyüme koni içinde indüklenen saptandı. Bu iletişim kuralı Aβ erken etkileri okumak yararlı olacaktır ve daha verimli ve önleyici reklam tedavi neden olabilir.
Introduction
Amiloid-β (Aβ) mevduat Alzheimer hastalığı (Ah) hastalarda beyin bulunur ve nöronal ağlar, bozabilir reklam1 bellek bozuklukları2,3,4‘ e giden kritik bir nedeni olarak kabul edilir. Birçok klinik ilaç adaylarının etkili amiloid-β (Aβ) üretim önlemek veya Aβ mevduat kaldırma gösterilmiştir. Ancak, hiçbiri reklam hastalar5işlevinde bellek iyileştirmede başarılı olması. Aβ bellek bozuklukları6başlangıcından önce beyinde yatırılır; Bu nedenle, hastaların beyinlerinin seviyelerinde Aβ azalan sergileri bellek bozuklukları etkisiz olabilir. Aβ ifade preklinik reklam hastalarda mevcuttur; Ancak, bu hastaların nadiren nöronal dejenerasyon ve bellek açıkları6ile mevcut. Aβ ifade ve bellek bozuklukları arasında bir zaman farkı vardır. Bu nedenle, reklam önlenmesi için kritik bir strateji Aβ toksisite reklam, önce bellek açıkları gelişimi erken aşamalarında sinyali engelliyor. Aβ ifade için bir bozulma yol açabilir axon dejenerasyon7,8,9,10,11,12,13, neden olmaktadır. sinir ağları ve bellek işlevinin sürekli bozulma. Birçok çalışma mekanizmaları Aβ toksisite araştırdık; Örneğin, dejenere aksonlar, reklam farelerin beyinlerinin autophagy14artış gösterilmiştir. Kalsinörin harekete geçirmek aksonal dejenerasyon Aβ kaynaklı15olası bir mekanizma olarak bildirilmiştir; Ancak, aksonal dejenerasyon doğrudan tetikleyici bilinmeyen kalır.
Bu çalışmada aksonal sonlar büyüme koniler olarak adlandırılan çöküşü odaklanır. Aksonal büyüme koniler çöküşü aksonal büyüme kovucular, semaphorin-3A ve ephrin-A516,17,18,19,gibi20neden olabilir. Çöküşü gibi distrofik aksonal sonlar hastalar21,22yılında beyinlerinde gözlenmiştir. Ayrıca, büyüme koni işleyen bir başarısızlık aksonal dejenerasyon23sebep olabilir. Ancak, ister Aβ büyüme koni Daralt indükler bilinmemektedir. Bu nedenle, bu çalışmada Aβ erken etkileri kültürlü nöronlar içinde gözlemlemek ve Aβ kaynaklı büyüme koni Daralt araştırmak için yeni bir protokol sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada açıklanan protokol aksonal büyüme koniler erken olayları gözlem Aβ1-42 tedaviden sonra etkin. Aβ1-42 endositoz aksonal büyüme koni içinde 20 dk içinde indüklenen ve büyüme koni Daralt tedavinin içinde 1 h gözlendi. Bu endositoz muhtemelen clathrin tarafından aracılık. Bu iletişim kuralını kullanarak, clathrin-aracılı endositoz inhibisyonu Aβ1 42 bağlı büyüme koni çöküşü ve kültürlü nöronlar27aksonal dejenerasyon önlemek için doğrulandı. Ay…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen JSP’ler gelen araştırma hibe tarafından desteklenmiştir (KAKENHI 18K 07389), Japonya, Takeda Bilim Vakfı, Japonya ve Kobayashi ilaç Co., Ltd., Japonya.
Materials
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Riferimenti
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
- Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer’s disease. Neuroscienze. 105 (1), 99-107 (2001).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer’s disease. Mount Sinai Journal of Medicine. 77 (1), 32-42 (2010).
- Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer’s Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
- Jack, C. R., et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer’s pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
- Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer’s disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535 (2012).
- Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
- Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
- Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer’s disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
- Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
- Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer’s mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
- Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
- Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
- Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
- Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
- Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscienze. 42 (3), 651-660 (1991).
- Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer’s disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
- Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
- Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
- Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
- Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
- Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
- Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
- Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer’s Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805 (2017).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
- De Felice, F. G., et al. Alzheimer’s disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
- Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
- Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer’s beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
- Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
- Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
- Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
- Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
- Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
- Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
- Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
- Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).
