Ett detaljerat protokoll för samtidiga driften av 48 parallella cellodlingar under varierande förhållanden i ett microbioreactor system presenteras. Cellodlingsprocessen, skörd och efterföljande antikropp titer analys beskrivs.
Automatiserad hur provtagningsutrustningen skall bioreaktorer (15 mL) kan vara ett användbart verktyg för cell kultur ingenjörer. De underlättar den samtidig körningen av en rad olika experimentella villkor samtidigt minimera potentiella process variabilitet. Tillämpningar av detta synsätt inkluderar: klon screening, temperatur och pH förändringar, tillägg och media optimering. Dessutom bidrar de små reactor volymerna till stora Design av experiment att undersöka en rad villkor. Detta tillåter uppströms processer optimeras betydligt innan skala upp där experimenterande är mer begränsad i omfattning på grund av tid och ekonomiska begränsningar. Automatiserad hur provtagningsutrustningen skall bioreaktor systems erbjuder olika fördelar jämfört med traditionella småskaliga cell kultur enheter, till exempel shake kolvar eller spinner kolvar. Dock under pilotskala måste process utveckling betydande vara försiktig att säkerställa att dessa fördelar realiseras. När kör med omsorg, systemet kan aktivera hög nivå automation, kan programmeras att köra does med ett högre antal variabler och kan minska provtagningstiden när integrerad med en näringsämnen analyzer eller cell räknare. Integrationen av den expert-derived heuristik presenteras här, med nuvarande automatiserade hur provtagningsutrustningen skall bioreaktor experiment kan minimera vanliga fallgropar som hindrar meningsfulla resultat. I extrema, kan underlåtelse att följa de principer som anges här leda till skada på utrustningen som kräver dyra reparationer. De microbioreactor system har dessutom små kulturvolymer som försvårar karakterisering av cell odlingsbetingelser. Antal och belopp av prover i processen i batch-läge kultur är begränsat eftersom operativa volymer inte kan understiga 10 mL. Denna metod kommer att diskutera fördelar och nackdelar hur provtagningsutrustningen skall bioreaktor system.
Monoklonala antikroppar (mAbs) tillverkades först i mus Hybridomteknik celler i 19751. Sedan dess skett en ökning i utvecklingen av rekombinant proteinproduktion att humanisera mAbs ökning i vivo säkerhet och effekt2,3,4. De flesta av rekombinant protein produktionsprocesserna anställa från kinesisk Hamster (CHO) celler för den lätthet med vilken de kan anpassas till serum fria medier, sin förmåga att producera proteiner med liknande post-translationella modifieringar som en medfödd mänskliga protein och deras pålitlighet som värd celler5,6.
Efterfrågan växer att leverera produkten snabbare och större patientgrupper med jämn kvalitet. Förutom de ekonomiska fördelarna ökar repertoaren av sjukdomar som behandlas av mAbs, som nu omfattar autoimmuna sjukdomar, efter transplantation komplikationer, artrit och cancer7. Genomsnittsavkastningen för moderna kommersiella mAb produktionslinjer är normalt i intervallet 5-6 g/l och fortsätter att stiga5. Detta har delvis åstadkommits genom CHO cell teknik och förbättrad produktionslinje screening med hög genomströmning bioreaktorer8. Dock har de flesta ökningar proteinproduktion tillskrivits för att bearbeta förbättringar, inklusive framsteg i media optimering, cell odlingsbetingelser, och förbättrad utfodring strategier7,9,10. Näringsrikt tillskott är viktigt inte bara för korrekt celltillväxt men också för effektiv produktion av högkvalitativt protein. Dessutom kräver celler stökiometriska tillägg av specifika näringsämnen, som kräver ytterligare förståelse för utfodring strategi optimering6,11. Traditionella optimeringsmetoder omfattar enskilda medier komponent titrering och blandning med blandning mönster. Men metoderna är tidskrävande, labor intensiv och innebära risker associerade med mänskliga fel12,13.
Optimering mediestudier åberopade tidigare skaka kolvarna och 1-2 L bioreaktorer som kan vara oöverkomligt dyrt i form av råvaror och humankapital. Mikroplattor har också använts men dessa metoder ger begränsad utbyggbarhet. Detta kan dessutom fortfarande kräva flera tidskrävande körningar som införa sats till sats variabilitet som skymmer den Kreditvärdighetsbedömning variationen orsakas av media sammansättning och utfodring strategi14,15,16. Därmed, behovet av stora dataflöden och konsekvent parallella bioreaktor system uppstått17,18,19,20.
Med betydande kostnaderna associerade med driften av traditionell bänk skala bioreaktorer (0,5-5 L), microbioreactors erbjuda ett kostnadsbesparande alternativ för att bedöma produktion av biologiskt härrör droger. 21 bänk skala rörs-tank bioreaktorer är pålitlig och ger täta data via sensoriska matriser. Feedback styrsystem möjliggör enkel övervakning av drift. Men gör församlingen, kalibrering, rengöring, arbetskostnader, substrat kostnader, och sterilisering krav bänk skala rörs-tank bioreaktorer dyrt och arbetskrävande att fungera. Skaka kolvarna och mikrotiter plattor bort några av kostnaden och arbete problem i samband med större skala bioreaktorer, men dessa alternativ ger svag kontroll över bearbetningsförhållanden och producera låg densitet data, ofta endast slutpunkten mätningar. 22
Alternativt kan utnyttja microbioreactors en liten arbetande volym för att ge en skala-down-strategi att cellen fodrar och uppströms processutveckling. Omfattningen av microbioreactor experiment kan avsevärt minska driftskostnader genom lägre utnyttjandegrad av makt, substrat, labor, utrymme och verktyg. 23 Microbioreactors är som skaka kolvarna i att de är lätta att hantera på grund av sin storlek, men de behåller fördelarna med traditionell bänk skala bioreaktorer via deras online feedback kontroll av pH, temperatur, upplöst syre, och syra/bas konsumtion samt deras realtidsdata produktion av kvalitetsparametrar inklusive off gassammansättning. Microbioreactor skala möjliggör hög genomströmning screening kapacitet, vilket kan vara användbart för klon urval och process utveckling. 24
Den avancerade hur provtagningsutrustningen skall bioreaktor har visat sig vara ett effektivt verktyg för CHO cell kultur processen karakterisering och utveckling18. Häri, en automatiserad ambr15 system, bestående av 48 microbioreactors parallellt, som har visat sig vara jämförbar med klassiskt stirred tank reaktorer i skala upp studier,25 användes på ett sätt som är jämförbar med tidigare arbete som optimerade media sammansättning för en CHO-DG44 cellinje producera en modell chimära IgG16. Effekterna av varierande media förhållanden på tillväxt och antikroppnivåns var jämförs och analyseras. En allmän riktlinje att köra microbioreactor system och analys av rå media prover har presenterats i denna uppsats.
Kör automatisk micro bioreaktor systemet ordentligt och innebär effektivt snabba avrättningen av flera automatiserade steg. En av de viktigaste delarna av kör systemet programmering programvaran. Om det finns något fel medan du skriver programmet, blir det allvarliga fel i experimentet som kan resultera i oväntade ändringar i processen, utfodring strategi, provtagningsstrategi eller slutproduktens kvalitet som kan ogiltigförklara resultaten av studien. En annan viktig aspekt av kör systemet är att placera och dra åt klämman plattan korrekt för att säkerställa korrekt kontroll. Den vanligaste indikationen att klämma plattan har skärpts ojämnt är oväntade variationer i mätningarna för fartyg 1, 6, 7 och 12 (hörnet reaktorn fartyg). Övergripande indikerar instabilitet en uppluckring av packningar på gas inlopp raderna i klämman plattorna. Detta scenario kan hindra att nå börvärdet. En annan vanlig fallgrop att undvika när du börjar ett experiment är att låta cellerna sitta alltför länge under inympning steg, vilket får dem att lösa. Den mindre tid cellerna sitter, skadar desto mindre chans finns det att progressivt lägre inokulum blodkroppar läggs kronologiskt till reaktorn kärlen som kan orsaka betydande bias som omedvetet studieresultat. Det är bättre att Inokulera i flera etapper, dvs. Inokulera varje kultur station efter varandra med paus steg däremellan så cellerna inte sitter i inympning plattan för längre än 15 minuter.
Om daglig användning, att upprätthålla sterilitet är avgörande. Även om systemet är i biologiska säkerhetsdragskåp, garanteras sterilitet inte på grund av frekventa förflyttningar in och ut ur motorhuven. Därför måste allt som går i huven besprutas med 70% IPA. För det andra är det viktigt att säkerställa att minimal skumbildning inträffar under kulturen. Media kan täppa till gasning och uttömma linjer, vilket leder till skada av klämman plattan och även kärnkomponenter nedan. Förebyggande anti skum tillägg steg är kritiska i någon mikro bioreaktor programdesign. I händelse av en ”skum ut” det skulle vara fördelaktigt att följa tillverkarna rengöring protokoll och kan förhindra permanenta skador av klämman plattor. Alternativt, användning av icke-sparged fartyg kan vara fördelaktigt för lägre cell tätheter eller när körs i batchläge högre yta att volymförhållandet möjliggör effektiv syre även med avsaknaden av en sparger. Icke-sparged fartyg kan dock inte användbar för hög densitet eller perfusion cellkulturer som huvud utrymmet är otillräckligt för att hänga med de kulturer som ökad förbrukning av syre.
Det finns många fördelar som tillhandahålls av det microbioreactor systemet, eftersom det möjliggör flera kontrollerade kulturer ska köras parallellt i en liten skala med större kontroll än skaka kolvarna. 17 därför systemet underlättar utförandet av screening studier, gör, hög genomströmning klon studier och transfection studier. Automatiserad vätskehantering minskar också analytiker-till-analytiker variabilitet och samtidigt minimera tråkiga och tidskrävande arbete för utbildad personal. Medan det finns flera fördelar med systemet, finns det flera viktiga nackdelar som bör övervägas. Först, en kultur volym 15 ml avsevärt begränsar i processen provtagning och sista skörden material och flera alternativa småskaliga bioreaktorer (upp till 500 mL) har nyligen blivit tillgängliga. En senaste befordran till systemet är att integrera den automatiserade hur provtagningsutrustningen skall bioreaktor med BioProfile FLEX 2 analyzer från Nova Biomedical, som mildrar i provtagning frågan genom att reducera provvolymen för cell densiteten och näringsämne analys . Fördelarna kan inkludera Snabbinstallation och praktiskt taget ingen rengöring leder till operativa besparingar, men kostnaden för disponibla enheter bör övervägas för lång sikt projekt eftersom det kan vara dyrare att köpa enheter än de återanvändbara konventionella system.
Den metod som diskuteras i detta dokument är främst lämplig för batch mode cellkultur, men kan ändras beroende på användarens behov. Varje kultur station har oberoende kontroll av temperatur, medan och pH kan varieras på nivån för enskilda reaktorn fartyg. Sartorius erbjuder också DoE planering programvara som utformats speciellt för att tillåta experiment skräddarsys för micro bioreaktor systemet. Storskaliga DoE studier med hjälp av nya DoE programvara från tillverkaren kan hjälpa i media och komplettera optimering. Även om inte används här, möjliggör microbioreactor systemet också matas-batch studier. Systemet har ännu inte optimerats för perfusion cellkulturer. Det har dock begränsade studier och prövningar för att efterlikna perfusion cell kultur drift i nuvarande micro bioreaktor systemet. 26 denna metod kan ändras för att efterlikna hög densitet perfusion kulturer av cell lösa. Genom att variera höjden som Pipettera sätts in i reaktorn och genom att optimera lösa tid, kan media tas bort och fyllas på till spegelläge överflöd av kultur. Det finns nya produkter i denna utvecklande område som kan fungera bättre än det system som presenteras här önskas perfusion funktionsläget av kultur.
Sammanfattningsvis, denna studie visar användningen av automatiserade mikro-bioreaktorer och tillhörande analytisk för CHO cell kultur verksamhet att producera och karakterisera en modell IgG1 monoklonal antikropp. Den betonar den roll liten skala mikro-bioreaktorer spelar i bioprocess tillverkning och deras påverkan på kultur celltillväxt och media screening. Medan det finns många fördelar med att använda ett automatiserat småskaliga system, för att fullt ut förverkliga sina förmåner bearbeta förståelse och analytiska karakterisering är absolut nödvändigt. Denna studie ger användaren med en riktlinje för att använda ett automatiserat hur provtagningsutrustningen skall reaktorn system, som kan utvecklas och förbättras per Forskningsbehovet på enskilda områden.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Scott Lute för det analytiska stöd som de ges. Partiell intern finansiering och stöd för detta arbete var som tillhandahålls av CDER kritisk sökväg programmet (CA #1-13). Projektet stöddes delvis av en utnämning till deltagande praktik/forskningsprogrammet på Office av biotekniska produkter, US Food and Drug Administration, administreras av Oak Ridge Institutet för vetenskap och utbildning genom en institutionsöverskridande avtal mellan US Department of Energy och FDA.
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |