In Vivo spårning av tymocyter i främre kammaren i ögat av laserscanning mikroskopi i realtid
Summary
Syftet med protokollet är att Visa längsgående intravital realtidsspårning av tymocyter av laserscanning mikroskopi i thymic implantat i främre ögonkammaren på möss. Insyn i hornhinnan och vaskularisering av graften tillåter kontinuerligt inspelning progenitor cell rekrytering och mogna T-cell avstigning.
Abstract
Syftet med metoden som presenteras är att visa, för första gången, transplantation av nyfödda thymi in i främre öga kammaren av syngena vuxna möss för i vivo längsgående realtidsövervakning av thymocytes´ dynamik inom en simblåsa Thymus segment. Efter transplantation tillåter laserscanning mikroskopi (LSM) genom hornhinnan i vivo noninvasiv upprepade bildbehandling på cellulär resolution nivå. Ännu viktigare, lägger metoden till föregående intravital T-cell mognad imaging modeller möjligheten för kontinuerlig progenitor cell rekrytering och mogna T-cell avstigning inspelningar på samma djur. Ytterligare fördelar med systemet är insynen i ympade området, tillåter makroskopiska snabb övervakning av implanterade vävnad, och tillgängligheten till implantatet möjliggör lokaliserade förutom systemiska behandlingar. Den största begränsningen är volymen på vävnaden som passar i det reducera utrymmet öga avdelning som krav för LOB trimning. Orgel integritet maximeras genom att dissekera bräss lober i mönster som tidigare visat sig vara funktionell för mogna T-cell produktion. Tekniken är potentiellt lämpade att förhöra en miljö av medicinskt relevanta frågor som avser bräss funktion som omfattar autoimmunitet, immunbrist och centrala tolerans; processer som förblir slentrianmässigt dåligt definierade. Fina dissektion av mekanismer som styr thymocyte migration, differentiering och urval bör leda till nya terapeutiska strategier inriktning utveckla T-celler.
Introduction
Intrathymic T-cell differentiering och T-cell subpopulation urval utgör viktiga processer för utveckling och underhåll av cell-medierad immunitet i ryggradsdjur1. Denna process innefattar en komplicerad händelseförlopp tätt organiserade inklusive rekryteringen av stamfäder från blodomloppet, cellproliferation och migration, differentiell uttryck av membranproteiner, och massiva programmerad celldöd för undergrupper urval. Resultatet är frisättningen av mogna T-celler reagerar snabbt på ett stort spektrum av främmande antigener medan du visar minimerade Svaren till self-peptider, som slut upp kolonisera de perifera lymfoida organ av enskilda2,3. Avvikande thymocyte urval av αβTCR repertoaren leder till autoimmun sjukdom eller immuna obalans4 som främst härrör från defekter under processerna för negativ eller positiv föregångare urval, respektive.
Directional migration av tymocyter över tymus är inneboende på alla stadier av T-cell mognad och det är tänkt som en serie av simultana eller sekventiella flera stimuli, inklusive chemokiner, självhäftande, och de självhäftande extracellulär matrix (ECM) protein interaktioner3,5. Studien av fasta vävnader har återges kritisk information angående mönster av uttryck för thymocyte flyttande signaler definierade thymic mikromiljö5,6, medan ex vivo -studier har avslöjat två förhärskande flyttande beteenden av tymocyter två histologiskt distinkta områden av orgeln: slow stokastiska rörelser i cortex och snabb, trånga motilitet i medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. ökad flyttande priser korrelerar med thymic positiva urval13 och negativa urval är associerad med krypande beteende stödja hypotesen att kinetiken för resan genom bräss bestämmer rätt mognaden av tymocyter. Trots deras relevans fortfarande topologi thymocyte-stromal cell interaktioner och dynamiken i thymocyte motilitet över orgel mikromiljö under T-cell mognad oklara.
De flesta ex vivo studier hittills inkluderar fostrets eller reaggregate thymic orgel kulturer14,15, vävnad skivor eller intakt thymic LOB bladsticklingar där thymocyte rörelser visualiseras av två-photon laserskanning mikroskopi (TPLSM)8, en intravital bildteknik med högst begränsade arbetsavstånd och imaging djup av 1 mm i enlighet med vävnaden undersöks16. I motsats till den mödosamma thymic orgel-kulturer som beror på längre inkubationstider att bilda 3D-strukturer, både thymic slice tekniken och intakt thymic LOB strategi tillstånd kontrolleras införandet av särskilda grupper av pre märkt tymocyter i en miljö med infödda vävnad i arkitekturen. Men eftersom blodflödet är frånvarande i dessa modeller, de är klart begränsade för att studera rekryteringsprocessen av tymus lösa stamfäder (TSP) till tymus parenkymet eller dynamiken i thymic egression av mogna T-celler.
In vivo modeller för att studera thymic T-cell mognad fysiologi hos möss inkluderar grafterna av fragment eller hela orgel lober placeras antingen inuti njuren kapsel17 eller intradermalt18. Även om alternativen visade deras verktyg för att förhöra systemisk funktionell engraftment av vävnad, begränsar positionen för thymic ympkvistar djupt inom djuret eller omfattas av lager av ogenomskinlig vävnad deras användning i vivo undersökning av implantat av TPLSM.
Den främre kammaren i ögat ger en lättillgänglig plats för direkt övervakning av någon ympade vävnad genom insyn i hornhinnans lager. Fördel är basen av kammaren bildas av iris rik på blodkärl och autonoma nervändar, vilket möjliggör snabb revaskularisering och reinnervation av ympkvistar19,20. Dr. Caicedo har framgångsrikt använt denna anatomiska utrymme för underhåll och longitudinell studie av Langerhanska i tidigare21. Här visar vi att denna strategi inte bara utgör en giltig metod för att studera tymocyter dynamics inom infödda orgel struktur, men också unikt tillstånd för att förlänga den i vivo längsgående inspelningar till studien av stamceller rekrytering och mogna T-cell egression steg i musen.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av vikten av T-cell mognadsprocessen för enskilda immun kompetensen4 och förmodade effekterna av föregångare cell dynamics på mogna T-celler produceras av tymus2,3, har omfattande ansträngningar investerats att utveckla alternativ till den klassiska fasta vävnad snapshot strategin.
Även om vävnad skivor och andra bladsticklingar är klart överlägsen i reproducera vävnad arkitektur än enski…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd genom NIH grants R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) och R21ES025673 (AC) och bästa/2015/043 bidraget (Consellería de Educació, cultura jag esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spanien) (EO). Författarna vill tacka skickat laget vid Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanien och Alberto Hernandez på Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanien för hjälp med video filmning och redigering.
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
Riferimenti
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).
- Dzhagalov, I., Phee, H. How to find your way through the thymus: a practical guide for aspiring T cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (5), 663-682 (2012).
- James, K. D., Jenkinson, W. E. &. a. m. p. ;., Anderson, G. T-cell egress from the thymus: Should I stay or should I go?. Journal of Leukocyte Biology. , (2018).
- Savino, W., Mendes-Da-Cruz, D. A., Smaniotto, S., Silva-Monteiro, E., Villa-Verde, D. M. Molecular mechanisms governing thymocyte migration: combined role of chemokines and extracellular matrix. Journal of Leukocyte Biology. 75 (6), 951-961 (2004).
- Petrie, H. T., Zúñiga-Pflücker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annual Review of Immunology. 25, 649-679 (2007).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Ladi, E., Herzmark, P., Robey, E. In situ imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (11), e652 (2008).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nature Immunology. 6, 143-151 (2005).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Le Borgne, M., Ladi, E., Dzhagalov, I., Herzmark, P., Liao, Y. F., Chakraborty, A. K., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature Immunology. 10, 823-830 (2009).
- Sanos, S. L., Nowak, J., Fallet, M., Bajenoff, M. Stromal cell networks regulate thymocyte migration and dendritic cell behavior in the thymus. Journal of Immunology. 186, 2835-2841 (2011).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed migration of positively selected thymocytes visualized in real time. PLoS Biology. 3 (6), e160 (2005).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current Protocols in Immunology. , (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), e905 (2008).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy. ILAR Journal. 49, 66-77 (2008).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- Li, J., Iwanami, N., Hoa, V. Q., Furutani-Seiki, M., Takahama, Y. Noninvasive intravital imaging of thymocyte dynamics in medaka. Journal of Immunology. 179 (3), 1605-1615 (2007).
- Adeghate, E. Host-graft circulation and vascular morphology in pancreatic tissue transplants in rats. Anatomical Record. 251, 448-459 (1998).
- Adeghate, E. Pancreatic tissue grafts are reinnervated by neuro-peptidergic and cholinergic nerves within five days of transplantation. Transplant Immunology. 10 (1), 73-80 (2002).
- Speier, S., Nyqvist, D., Köhler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nature Medicine. 14 (5), 574-578 (2008).
- Morillon, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. 99 (99), (2015).
- Liu, L. L., Du, X. M., Wang, Z., Wu, B. J., Jin, M., Xin, B., et al. A simplified intrathymic injection technique for mice. Biotechnic & Histochemestry. 87 (2), 140-147 (2012).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12863-12868 (2011).
