激光扫描显微术实时跟踪眼球前室胸腺细胞
Summary
该协议的目的是通过激光扫描显微镜在小鼠眼前腔的胸腺植入物中显示胸腺细胞的纵向活体实时跟踪。角膜的透明度和移植的血管化允许持续记录祖细胞的招募和成熟的 T 细胞出口。
Abstract
所提出的方法的目的是首次显示, 新生儿 thymi 移植到等基因系成年小鼠的前眼室,在体内纵向实时监测 thymocytes´动态在血管内胸腺段。在移植后, 激光扫描显微镜 (LSM) 通过角膜允许在体内无创重复成像的细胞分辨率水平。重要的是, 该方法增加了以前的活体 T 细胞成熟成像模型的可能性, 连续祖细胞招募和成熟的 T 细胞出口记录在同一动物。该系统的额外优点是移植区的透明度, 允许对植入组织进行宏观的快速监测, 以及植入物的可移植性, 除了系统治疗外, 还可以进行局部化处理。主要的限制是组织的体积, 适合在减少的空间的眼睛室, 要求裂片修剪。通过解剖胸腺裂片, 在先前显示为成熟 T 细胞生产功能的模式中, 器官完整性最大化。该技术可能适合于询问与胸腺功能相关的医学相关问题的环境, 包括自身免疫、免疫机能丧失和中枢耐受;仍然机械化的过程。对诱导胸腺细胞迁移、分化和选择的机制进行精细的解剖, 将会导致新的治疗策略以发展 T 淋巴细胞为目标。
Introduction
胸腺 t 细胞分化和 t 细胞亚群选择是发展和维持细胞介导免疫在脊椎动物1的关键过程。这一过程涉及复杂有序的活动序列, 包括从血液中招募祖细胞, 增殖和迁移, 膜蛋白的差异表达, 以及大规模程序性细胞死亡的子集选择。其结果是, 成熟的 T 细胞的释放反应到丰富的外国抗原, 同时显示最小的反应, 自肽, 最终殖民的外围淋巴器官的个体2,3。αβTCR 的异常胸腺细胞选择导致自身免疫性疾病或免疫失衡4 , 主要来源于在阴性或阳性前体选择过程中的缺陷。
胸腺胸腺的定向迁移是 T 细胞成熟的所有阶段的内在特性, 它被设想为一系列同时或连续的多重刺激, 包括趋化因子、粘合剂和脱粘细胞外基质 (ECM)。蛋白质相互作用3,5。对固定组织的研究为胸腺微环境5、6中胸腺细胞迁移线索的表达模式提供了关键信息, 而活体研究揭示了两种常见的胸腺细胞在两个组织学不同区域的迁移行为: 皮质缓慢随机运动, 髓质7,8,9,10,11,12,13. 移徙率增加与胸腺阳性选择13相关, 阴性选择与爬行行为有关, 这一假说表明, 通过胸腺进行的旅程的动力学决定适当的胸腺细胞的成熟。尽管它们的相关性, 胸腺细胞间质细胞相互作用的拓扑结构和胸腺组织运动的动力学在器官微环境期间在 T 体细胞成熟仍然是未定义的。
迄今进行的大多数活体研究包括胎儿或 reaggregate 胸腺器官培养14、15、组织切片或完整的胸腺叶外植体, 在那里胸腺细胞运动通过双光子激光扫描可视化。显微术 (TPLSM)8, 活体成像技术, 限制最大工作距离和成像深度1毫米根据组织检查16。与依赖于延长潜伏期形成3维结构的艰苦的胸腺器官培养相比, 胸腺切片技术和完整的胸腺叶方法允许控制引入预先标记的特定子集胸腺细胞进入一个本土的组织建筑环境。然而, 由于这些模型中没有血流, 它们显然仅限于研究胸腺沉降祖 (TSPs) 对胸腺实质的招募过程或成熟 T 细胞胸腺 egression 的动力学。
在活体模型中研究胸腺 T 细胞成熟生理学的小鼠包括移植的片段或整个器官裂片放置在肾囊17或 intradermally18。虽然这些选择显示了他们的效用, 以询问组织的系统性功能植入, 胸腺移植的位置在动物深处或覆盖层的不透明组织限制其使用在体内检查植入物TPLSM。
由于角膜的透明度, 眼睛的前腔提供了一个容易接近的空间, 直接监测任何接枝组织。的优势, 虹膜形成的室的基础是丰富的血管和自主神经的结局, 使移植的快速重建和神经19,20。凯塞多博士在过去21成功地利用这个解剖空间进行胰岛的维持和纵向研究。在这里, 我们表明, 这一策略不仅是研究胸腺细胞在原生器官结构中的动力学的有效方法, 而且是唯一允许将体内纵向记录扩展到祖招募研究和成熟的 T 细胞 egression 的步骤在小鼠。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于 T 细胞成熟过程对个体免疫能力4的重要性以及前体细胞动力学对胸腺2、3所产生的成熟 T 细胞的推定影响, 已经投入了大量的努力。开发替代传统的固定组织快照方法。
虽然组织切片和其他外植体在再生组织结构上明显优于单分子膜或胸腺14、15的总器官培养, 但由?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 NIH 赠款 R56DK084321 (ac)、R01DK084321 (ac)、R01DK111538 (ac)、R01DK113093 (ac) 和 R21ES025673 (ac) 以及 BEST/2015/043 赠款 (Consellería Educació、文化宫 i 电子竞技、加泰罗尼亚自治区、巴伦西亚、西班牙) (《雇佣条例》) 的支持。作者感谢派出的团队在瓦伦西亚天主教 Mártir, 瓦伦西亚, 西班牙和中心 de Investigación 圣多美和普林西比马萨, 瓦伦西亚, 西班牙的帮助下, 视频拍摄和编辑。
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
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