लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा आंख के पूर्वकाल चैंबर में Vivo ट्रैकिंग Thymocytes में वास्तविक समय
Summary
प्रोटोकॉल के लक्ष्य को दिखाने के लिए अनुदैर्ध्य intravital वास्तविक समय लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा thymocytes की ट्रैकिंग thymic प्रत्यारोपण में माउस आंख के पूर्वकाल कक्ष में है । भ्रष्टाचार के कॉर्निया और vascularization की पारदर्शिता लगातार रिकॉर्डिंग जनक सेल भर्ती और परिपक्व टी सेल निकास के लिए अनुमति देता है ।
Abstract
प्रस्तुत किया जा रहा है विधि का उद्देश्य, पहली बार के लिए, vivo अनुदैर्ध्य में thymocytes ´ गतिशीलता के एक संवहनी के भीतर वास्तविक समय की निगरानी के लिए isogenic वयस्क चूहों के पूर्वकाल नेत्र कक्ष में नवजात thymi का प्रत्यारोपण थाइमस सेगमेंट. रोपाई के बाद, लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (LSM) कॉर्निया के माध्यम से vivo में सेलुलर संकल्प स्तर पर इनवेसिव दोहराया इमेजिंग की अनुमति देता है । महत्वपूर्ण बात, दृष्टिकोण पिछले intravital टी सेल परिपक्वता इमेजिंग मॉडल के लिए एक ही जानवर में सतत जनक सेल भर्ती और परिपक्व टी सेल निकास रिकॉर्डिंग के लिए संभावना कहते हैं । प्रणाली के अतिरिक्त लाभ भ्रष्टाचारी क्षेत्र की पारदर्शिता, प्रत्यारोपित ऊतक के macroscopic तेजी से निगरानी की अनुमति, और प्रणालीगत उपचार के अलावा स्थानीयकृत के लिए अनुमति प्रत्यारोपण के लिए पहुंच रहे हैं । मुख्य सीमा ऊतक की मात्रा जा रहा है कि आंख चैंबर के कम जगह में फिट बैठता है जो पालि trimming के लिए मांग करता है । अंग अखंडता पहले परिपक्व टी सेल उत्पादन के लिए कार्यात्मक हो दिखाया पैटर्न में विदारक थाइमस पालियों द्वारा अधिकतम है । तकनीक संभावित रूप से प्रतिरक्षा, इम्यूनो और केंद्रीय सहिष्णुता शामिल है कि थाइमस समारोह से संबंधित चिकित्सकीय प्रासंगिक सवालों के एक वातावरण पूछताछ करने के लिए अनुकूल है; प्रक्रियाओं जो mechanistically खराब परिभाषित रहते हैं । तंत्र के ठीक विच्छेदन thymocyte प्रवास मार्गदर्शक, भेदभाव और चयन उपंयास चिकित्सीय टी कोशिकाओं के विकास को लक्षित रणनीतियों को बढ़ावा देना चाहिए ।
Introduction
Intrathymic टी-सेल विभेद और टी सेल उप जनसंख्या चयन रीढ़1में कोशिका मध्यस्थता प्रतिरक्षा के विकास और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं का गठन । इस प्रक्रिया में खून से progenitors की भर्ती, सेल प्रसार और प्रवास, झिल्ली प्रोटीन की विभेदक अभिव्यक्ति, और सबसेट के लिए बड़े पैमाने पर क्रमादेशित सेल मौत सहित कसकर संगठित घटनाओं के एक जटिल अनुक्रम शामिल चयन. परिणाम परिपक्व टी की रिहाई के लिए विदेशी प्रतिजनों के एक पर्याप्त स्पेक्ट्रम के लिए प्रतिक्रियाशील है जबकि स्वयं पेप्टाइड्स, जो अंत तक व्यक्तिगत2,3के परिधीय लसीकावत् अंगों बस्तियां के लिए कम प्रतिक्रियाओं प्रदर्शित । αβTCR प्रदर्शनों की ंयायपालिका thymocyte चयन स्व-प्रतिरक्षित रोग या प्रतिरक्षा असंतुलन4 कि मुख्य रूप से नकारात्मक या सकारात्मक प्रणेता चयन की प्रक्रिया के दौरान दोषों से प्राप्त करने के लिए सुराग, क्रमशः ।
थाइमस भर thymocytes के दिशात्मक प्रवास टी के सभी चरणों के लिए आंतरिक है-सेल परिपक्वता और यह एक साथ की एक श्रृंखला के रूप में परिकल्पना की है, या अनुक्रमिक एकाधिक उत्तेजनाओं, सहित chemokines, चिपकने वाला, और de-चिपकने वाला extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन इंटरैक्शन3,5. फिक्स्ड ऊतकों के अध्ययन में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान की गई है thymocyte प्रवासी cues के लिए अभिव्यक्ति के पैटर्न के बारे में परिभाषित thymic microenvironments5,6, जबकि पूर्व vivo अध्ययन दो प्रचलित पता चला है दो histologically में thymocytes के प्रवासी व्यवहार अंग के विशिष्ट क्षेत्रों: प्रांतस्था और तेज, गतिशीलता7,8,9,10 में सिमटा मज्जा में धीमी गति से stochastic आंदोलनों , 11 , 12 , 13. बढ़ी हुई प्रवासी दरों thymic सकारात्मक चयन के साथ सहसंबंधी13 और नकारात्मक चयन की परिकल्पना का समर्थन रेंगने व्यवहार के साथ जुड़ा हुआ है कि थाइमस के माध्यम से यात्रा के कैनेटीक्स उचित निर्धारित करता है thymocytes की परिपक्वता । उनकी प्रासंगिकता के बावजूद, thymocyte के टोपोलॉजी-stromal सेल बातचीत और अंग microenvironments भर में thymocyte गतिशीलता की गतिशीलता टी सेल के दौरान परिपक्वता बीमार परिभाषित रहते हैं ।
सबसे पूर्व vivo अध्ययन तिथि करने के लिए प्रदर्शन किया भ्रूण या समग्र thymic अंग संस्कृतियों14,15, ऊतक स्लाइस या बरकरार thymic पालि explants जहां thymocyte आंदोलनों दो फोटॉन लेजर स्कैनिंग द्वारा कल्पना कर रहे है शामिल माइक्रोस्कोप (TPLSM)8, एक प्रतिबंधित अधिकतम काम की दूरी और इमेजिंग गहराई के साथ एक intravital इमेजिंग तकनीक के अनुसार 1 मिमी के ऊतकों की जांच की16. श्रमसाध्य thymic अंग संस्कृतियों जो विस्तारित मशीन समय पर निर्भर करने के लिए 3 डी संरचनाओं, दोनों के विपरीत, thymic टुकड़ा तकनीक और बरकरार thymic पालि दृष्टिकोण पूर्व के विशेष सबसेट का परिचय नियंत्रित अनुमति लेबल एक देशी ऊतक वास्तुकला वातावरण में thymocytes । हालांकि, के बाद से रक्त प्रवाह इन मॉडलों में अनुपस्थित है, वे स्पष्ट रूप से थाइमस पैरेन्काइमा या परिपक्व टी कोशिकाओं के thymic egression की गतिशीलता के लिए थाइमस बसने progenitors (TSPs) की भर्ती प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए सीमित हैं ।
thymic टी सेल के अध्ययन के लिए वीवो मॉडल में चूहों में परिपक्वता फिजियोलॉजी के टुकड़े या पूरे अंग या तो गुर्दे कैप्सूल के अंदर रखा पालियों17 या intradermally18के भ्रष्टाचार शामिल हैं । हालांकि इन विकल्पों के ऊतकों के प्रणालीगत कार्यात्मक engraftment पूछताछ करने के लिए अपनी उपयोगिता से पता चला, thymic की स्थिति में गहरे जानवर या अपारदर्शी ऊतक की परतों द्वारा कवर के लिए उनके उपयोग को प्रतिबंधित करने के लिए vivo में प्रत्यारोपण के परीक्षा TPLSM ।
आंख के पूर्वकाल कक्ष corneal परतों की पारदर्शिता के आधार पर किसी भी भ्रष्टाचारी ऊतक के प्रत्यक्ष निगरानी के लिए एक आसानी से सुलभ जगह प्रदान करता है । लाभ के, आईरिस द्वारा गठित चैंबर के आधार रक्त वाहिकाओं और स्वायत्त तंत्रिका अंत में समृद्ध है, तेजी से revascularization और भ्रष्टाचारियों के reinnervation को सक्षम करने के19,20। डॉ Caicedo सफलतापूर्वक पिछले21में अग्नाशय के टाप के रखरखाव और अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए इस संरचनात्मक अंतरिक्ष का इस्तेमाल किया है । यहां, हम बताते है कि इस रणनीति न केवल मूल अंग संरचना के भीतर thymocytes ‘ गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक वैध दृष्टिकोण का गठन किया है, लेकिन यह भी अद्वितीय परमिट जनक भर्ती के अध्ययन के लिए vivo अनुदैर्ध्य रिकॉर्डिंग में विस्तार करने के लिए और परिपक्व टी सेल egression माउस में कदम ।
Protocol
Representative Results
Discussion
व्यक्तिगत प्रतिरक्षा क्षमता4 के लिए टी सेल परिपक्वता प्रक्रिया के महत्व और परिपक्व टी-थाइमस द्वारा उत्पादित कोशिकाओं पर अग्रदूत सेल गतिशीलता के माना प्रभाव के कारण2,3, व…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को NIH पलाश R56DK084321 (AC) ने सपोर्ट किया था, R01DK084321 (एसी), R01DK111538 (एसी), R01DK113093 (एसी), और R21ES025673 (एसी), और द्वारा सर्वश्रेष्ठ/2015/043 अनुदान (Consellería de Educació, cultura मैं esport, Generalitat valenciana, वालेंसिया, स्पेन) (ईओ) । लेखक अल्बर्टो de Hernandez Centro Investigación, वालेंसिया, स्पेन में Universidad Católica de वालेंसिया San विसेंट Mártir, वालेंसिया, स्पेन और Príncipe फेलिप पर भेजा टीम धंयवाद वीडियो फिल्माने और संपादन के साथ उनकी मदद के लिए ।
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
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