레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 눈의 앞쪽 챔버에 Thymocytes의 비보에 추적 실시간
Summary
프로토콜의 목표는 레이저 스캐닝 현미경 마우스 눈의 앞쪽 챔버에 thymic 임 플 란 트에 의해 thymocytes의 경도 intravital 실시간 추적을 보여주는 것입니다. 각 막의 투명도는 이식의 vascularization 지속적으로 녹음 시 조 셀 모집 및 성숙한 T 세포 출구 수 있습니다.
Abstract
제시 되는 방법의 목적은 쇼, 처음으로, vivo에서 경도 실시간 모니터링를 vascularized 내에서 thymocytes´ 역학의 isogenic 성인 쥐의 앞쪽 눈 챔버로 신생아 thymi의 이식 thymus 세그먼트입니다. 이식, 다음 레이저 스캐닝 현미경 (LSM) 각 막 통해 비보에 비 침 투 적인 반복된 이미징을 셀룰러 해상도 수준에서 수 있습니다. 중요 한 것은, 접근에 추가 이전 intravital T 세포 성숙 모델 이미징 연속 조상 세포 모집 및 성숙한 T 세포 출구 녹음에 대 한 가능성 같은 동물에서 합니다. 시스템의 추가 장점은 이식 조직의 거시적인 신속한 모니터링 허용 이식할 영역의 투명도 그리고 조직의 치료 뿐만 아니라 지역화 된 임 플 란 트에 대 한 허용에 대 한 접근. 주요 제한 되 고 조직의 볼륨을 엽 트리밍에 대 한 요구는 눈 챔버의 감소 된 공간에 맞는. 기관 무결성 패턴 이전 성숙한 T 세포 생산에 대 한 기능 표시 thymus 돌출부를 해 부하 여 최대화 됩니다. 기술은은 잠재적으로 환경 의학 관련 질문 thymus 함수에 관련 된 면역, 면역 결핍, 중앙 허용;의 적합 하다 프로세스 mechanistically 가난 하 게 정의 된 남아 있는입니다. 지도 thymocyte 마이그레이션, 차별화 및 선택 메커니즘의 미세 해 부 소설 치료 전략 개발 T 세포를 대상으로 지도 해야 한다.
Introduction
Intrathymic T-세포 분화 및 T 세포 부분 모집단 선택 개발 및 척추 동물1셀 중재 면역의 유지 보수에 대 한 핵심 프로세스를 구성합니다. 이 과정에서 혈액, 세포 증식 및 마이그레이션 창시자의 채용, 막 단백질, 그리고 하위 집합에 대 한 대규모 프로그램 된 세포 죽음의 차동 식 등 긴밀 하 게 조직 된 이벤트의 복잡 한 순서를 포함 선택입니다. 결과 T-세포로 성숙 외국 항 원의 넓은 스펙트럼에 반응의 출시 자체-펩 티 드, 최소화 된 응답을 표시 하는 동안 주변 림프 기관 개별2,3의 식민지는 끝낼. ΑβTCR 레 퍼 토리의 탈 선 thymocyte 선택 자가 면역 질환 또는 면역 불균형4 주로에서 파생 되는 결함의 음수 또는 양수 전조 선택 프로세스 동안 각각 이끌어 낸다.
Thymus 걸쳐 thymocytes의 방향 이동 T 세포 성숙의 모든 단계에 본질적인 것 이며 그것은 일련의 동시 또는 순차적으로 발산, 접착제를 포함 하 여 여러 자극을 상상 하 고 드 접착제 세포 외 기질 (ECM) 단백질 상호 작용3,5. 고정 조직의 연구는 렌더링 정의 thymic microenvironments5,6, thymocyte 철새 단서에 대 한 표현의 패턴에 관한 중요 한 정보 ex vivo 연구 두 계시는 동안 널리 장기의 2 개의 조직학 명백한 지역에서 thymocytes의 철새 행동: 느린 피 질에서 확률적 움직임과 빠른, 한정 된 운동 성 정도7,8,,910 , 11 , 12 , 13. thymic 긍정적인 선택13 연관 증가 철새 요금 및 부정적인 선택 가설 thymus 통해 여행의 활동 적절 한 결정을 지 원하는 크롤링 동작와 연결 된 thymocytes 성숙 그들의 관련성에도 불구 하 고 thymocyte stromal 세포 상호 작용의 토폴로지 및 기관 microenvironments T 세포 성숙 동안에 걸쳐 thymocyte 운동 역학 병이 정의 유지.
대부분의 비보 전 날짜를 수행 연구 태아 포함 또는 thymic 기관 문화14,15, 조직 조각 또는 그대로 thymic 엽 explants thymocyte 움직임 2 광자 레이저 스캔 하 여 시각화는 reaggregate 현미경 검사 법 (TPLSM)8을 제한 된 최대 작동 거리 및 조직에 따라 1 mm의 깊이 이미징 intravital 이미징 기술16를 검사 합니다. 3D 구조 형성을 연장된 보육 시간에 따라 달라 지는 힘 드는 thymic 기관 문화, 달리 thymic 조각 기술과 그대로 thymic 엽 접근 허가 제어 소개의 특정 하위 집합의 모두, 사전 분류 thymocytes 네이티브 조직 건축 환경에. 그러나, 혈액 흐름은 이후 결 석이 모델은 명확 thymus thymus 실질 또는 성숙한 T 세포의 thymic egression 역학 창시자 (TSPs) 정착의 채용 과정을 공부에 대 한 제한.
Vivo에서 모델 쥐에서 thymic T 세포 성숙 생리학의 연구에 대 한 조각 또는 중 신장 캡슐17 또는 intradermally18안으로 배치 하는 전체 기관 돌출부의 이식 포함 됩니다. 비록 이러한 옵션 보여 조직의 조직 기능 engraftment가 그들의 유틸리티, thymic 이식 동물 내에서 깊은 또는 불투명 직물의 층에 의해 덮여의 위치 비보에 의해 임 플 란 트의 시험에 대 한 그들의 사용 제한 TPLSM입니다.
눈의 앞쪽 챔버 각 막 레이어의 투명도 덕택으로 어떤 이식할 조직을 직접 모니터링을 위한 쉽게 접근할 수 있는 공간을 제공 합니다. 이점의 홍 채에 의해 형성 된 챔버의 혈관과 자율 신경 엔딩, 빠른 revascularization 및 이식19,20reinnervation 풍부 하다. 박사 Caicedo 성공적으로 유지 보수 및 지난21에서 췌 장 독도의 종 적 연구에 대 한이 해 부 공간을 사용 하고있다. 자, 우리 보여이 전략 뿐만 아니라 네이티브 기관 구조 내에서 thymocytes의 역학을 공부 하는 유효한 접근을 구성 하지만 또한 고유 하 게 확장 하는 비보에 조상 모집의 연구에 경도 기록을 허용 하 고 성숙한 T 세포 egression 단계 마우스입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
개별 면역 능력4 T 세포 성숙 과정의 중요성 및 성숙한 T 세포 thymus2,3에 의해 생산에 선구자 세포 역학의 추정된 영향, 광범위 한 노력이 투자 되었습니다. 대안 클래식 고정된 조직 스냅샷 접근을 개발 하십시오.
조직 조각과 다른 explants는 분명히 우수한 재현 monolayers 또는 집계 thymic 기관 문화14<s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 교부 금 R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) 및 R21ES025673 (AC)에 의해 고 최고/2015/043 그랜트에 의해 지원 되었다 (Consellería de Educació, 문화 나, esport Generalitat 발렌시아, 발렌시아, 스페인) (EO). 저자는 대학 Católica 드 발렌시아 산 비센테 Mártir, 발렌시아, 스페인, 센트로 데 Investigación 프린시페 펠리페, 발렌시아, 스페인에 대 한 그들의 비디오 촬영과 편집에서 알베르토 헤 르 난 데스에서 보낸 팀을 감사 합니다.
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
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