Seguimiento en Vivo de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real
Summary
El objetivo del protocolo es mostrar longitudinal intravital seguimiento en tiempo real de los timocitos por microscopía en implantes tímicos en la cámara anterior del ojo de ratón del laser. La transparencia de la córnea y la vascularización del injerto permiten grabar continuamente reclutamiento de células progenitoras y salida de células T madura.
Abstract
El propósito del método presentado es mostrar, por primera vez, el trasplante de thymi recién en la cámara anterior del ojo de ratones adultos isogénicas para en vivo longitudinal seguimiento en tiempo real de la dinámica de thymocytes´ dentro de un vascularizado segmento de timo. Después del trasplante, láser, microscopía (LSM) a través de la córnea permite que en vivo no invasor proyección de imagen repetida a nivel celular de resolución. Lo importante es el enfoque agrega a maduración de células T intravital anterior imagen modelos la posibilidad de reclutamiento de células progenitoras continua y grabaciones de salida de células T maduras en el mismo animal. Ventajas adicionales del sistema son la transparencia de la zona injertada, permitiendo monitoreo rápido macroscópica del tejido implantado, y la accesibilidad al implante que permite localiza además de tratamientos sistémicos. La principal limitación es el volumen del tejido se ajusta en el reducido espacio de la cámara de ojo que exige para el ajuste del lóbulo. Se maximiza la integridad del órgano por disección lóbulos del timo en los patrones previamente demostrados ser funcionales para la producción de células T madura. La técnica es potencialmente adecuada para interrogar a un entorno de médicamente relevantes cuestiones relacionadas con la función del timo que incluyen autoinmunidad, inmunodeficiencia y tolerancia central; procesos que siguen siendo mecánico mal definidos. La disección fina de mecanismos rectores thymocyte migración, diferenciación y selección debe conducir a nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a células T en desarrollo.
Introduction
Diferenciación intratímica de células T y células T subpoblación selección constituyen procesos claves para el desarrollo y mantenimiento de la inmunidad mediada por células en vertebrados1. Este proceso implica una compleja secuencia de eventos firmemente organizados incluyendo el reclutamiento de progenitores de sangre, proliferación celular y migración, expresión diferencial de proteínas de la membrana y muerte celular programada masiva para subconjuntos selección. El resultado es la liberación de células T maduras reactivas a un amplio espectro de antígenos extraños mientras se muestra minimizado las respuestas para auto-péptidos, que final-hasta colonizar los órganos linfoides periféricos de los2,3. Selección de timocitos aberrante del repertorio αβTCR conduce a enfermedades autoinmunes o desequilibrio inmune4 que derivan principalmente de defectos durante los procesos de selección de precursor positiva o negativa, respectivamente.
La migración direccional de los timocitos en el timo es intrínseca a todas las etapas de maduración de la célula de T y es concebido como una serie de simultáneas o secuenciales múltiples estímulos, como quimioquinas, adhesivo, y pegamento de la matriz extracelular (ECM) proteína las interacciones3,5. El estudio de los tejidos fijos ha prestado información crítica con respecto a los patrones de expresión para señales migratorias thymocyte en microambientes tímicos definido5,6, mientras que los estudios ex vivo ha revelado dos frecuentes comportamientos migratorios de los timocitos en dos áreas histológico del órgano: lentos movimientos estocásticos en la corteza y la movilidad rápida, confinada en la médula7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. aumento tasas migratorias correlacionan con selección positiva tímica13 y selección negativa se asocia con comportamientos rastreros apoyan la hipótesis de que la cinética de la travesía por el timo determina apropiado maduración de los timocitos. A pesar de su importancia, la topología de las interacciones de células estromales de timocitos y la dinámica de movilidad de timocitos en microambientes del órgano durante la maduración de células T siendo mal definida.
Mayoría ex vivo de los estudios realizados hasta la fecha incluyen fetales o reagregarse timo órgano culturas14,15, rebanadas de tejido o explantes lóbulo tímico intacta donde se visualizan los movimientos anti-thymocyte por escaneo láser de dos fotones microscopia (TPLSM)8, una técnica con un máximo restringido distancia y profundidad de 1 mm según el tejido de imágenes intravital examinó16. En contraste con las culturas de órgano timo laboriosa en tiempos de incubación extendido para formar estructuras de 3D, tanto la técnica de slice tímico y la introducción de permiso de control de enfoque lóbulo tímico intacto de subconjuntos particulares de la etiqueta timocitos en un entorno de arquitectura de tejido propio. Sin embargo, puesto que el flujo sanguíneo está ausente en estos modelos, están claramente limitados para estudiar el proceso de contratación de timo colocar progenitores (TSPs) el parénquima del timo o la dinámica de egression timo de células T maduras.
Modelos in vivo para el estudio de la fisiología de maduración de células T tímico en ratones son los injertos de fragmentos o lóbulos del órgano entero colocados ya sea dentro de la cápsula renal17 o por vía intradérmica18. Aunque estas opciones demostraron su utilidad para interrogar sistémico funcional engraftment del tejido, la posición de los injertos tímicos profundos dentro del animal o cubiertos por capas de tejido opaco restringe su uso en vivo examen de implantes por TPLSM.
La cámara anterior del ojo proporciona un espacio de fácil acceso para monitoreo directo de los tejidos injertados en virtud de la transparencia de las capas corneales. De ventaja, la base de la cámara formada por el iris es rica en vasos sanguíneos y las terminaciones nerviosas autonómicas, lo que permite la rápida revascularización y reinervación de los injertos19,20. Dr. Caicedo ha utilizado este espacio anatómico para el mantenimiento y el estudio longitudinal de islotes pancreáticos en los últimos21. Aquí, mostramos que esta estrategia no sólo constituye un enfoque válido para estudiar la dinámica de timocitos dentro de la estructura del órgano nativo, pero también únicamente permite extender el en vivo grabaciones longitudinales para el estudio del reclutamiento del progenitor y pasos de egression células T madurados en ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a la importancia de la maduración de células T para competencia inmune individual4 y el presunto impacto de precursor celular dinámica en células T maduras producidas por el timo2,3, se han invertido grandes esfuerzos desarrollar alternativas al enfoque clásico tejido fijo instantánea.
Aunque claramente superiores en la reproducción de la arquitectura del tejido de monocapas o agregado órgano timo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH R56DK084321 (CA), R01DK084321 (CA), R01DK111538 (CA), R01DK113093 (CA) y R21ES025673 (CA) y por la concesión del mejor/2015/043 (Consellería de Educació, cultura i esport, Generalitat valenciana, Valencia, España) (EO). Autores agradecen al equipo enviado a la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, España y Alberto Hernández en el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, España por su ayuda con video filmación y edición.
Materials
| Isofluorane vaporizer w/isofluorane | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| Dissecting scope w/light source | Zeiss | Stemi 305 | |
| Fine dissection forceps | WPI | 500455 | |
| Medium dissection forceps | WPI | 501252 | |
| Curved tip fine dissection forceps | WPI | 15917 | |
| Vannas scissors | WPI | 503371 | |
| Dissecting scissors | WPI | 503243 | |
| Scalpel | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G needles | BD | 304622 | |
| Disposable transfer pipette | Thermofisher | 201C | |
| Heat pad and heat lamp | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| Ethanol 70% | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm sterile dish | SIGMA | CLS430166 | |
| Sterile 1x PBS pH(7,4) | Thermofisher | 10010023 | |
| Sterile wipes | Kimberly-Clark | LD004 | |
| Drugs for pain management | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| Saline solution or Viscotears | Novartis | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ FLIII | |
| Head-holding adapter | Narishige | SG-4N-S | |
| Gas mask | Narishige | GM-4_S | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Laminar flow hood | Telstar | BIO IIA |
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